[发明专利]一种同时去除植物组织培养时外植体表面和内生菌的方法

说明书

本发明属于生物技术领域，尤其是植物组织培养技术领域，公开了一种同时去除植物组织培养时外植体表面和内生菌的方法。本发明采用50％的多菌灵对扦插土壤进行消毒处理，采用含有200mg/L两性霉素B和100mg/L硫酸链霉素的无菌水溶液对扦插枝条进行消毒处理，采用含有100mg/L两性霉素B和50mg/L硫酸链霉素的无菌水溶液对半木质化的新发枝条进行预处理，并且采用溶脂混合液对外植体进行预处理，从而能够有效清除杨树等外植体表面及内部的细菌及真菌，使外植体保持充足的活力。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是植物组织培养技术领域，具体涉及一种同时去除植物组织培养时外植体表面和内生菌的方法。

背景技术

杨树属于杨柳科(Salicacae)杨属(Populus L.)植物，为多年生木本乔木。杨树不仅是重要的造林绿化树种和工业用材树种，而且还是多年生林木基因工程的模式树种。因此，获得大量无菌的外植体是进行杨树组织快繁和基因工程研究的前提和基础。

杨树树种为多年生木本植物，树体内部常寄生有各种细菌及真菌。内生菌由于受到植物体的保护，采用常规的消毒方式往往仅能杀灭表面病菌，对内生菌无能为力，因此常在培养后造成培养物的再次污染。同时，杨树树种的冬眠芽在萌发时分泌大量树脂，新生枝条、顶芽及侧芽表面也覆盖树脂，采用常规的水溶性消毒液，无法消除外植体表面树脂中及树脂下的细菌和真菌，因此常常导致外植体消毒不彻底、污染率较高或者消毒过度致使外植体死亡等情况发生。目前能够同时杀灭杨树表面及内生菌的消毒方法尚无报道，因此亟待开发一种能够同时去除植物组织培养时外植体表面和内生菌的高效安全的消毒方法。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的上述缺陷，为改善常规消毒灭菌方式无法去除杨树等外植体表面和内生菌的不足，提供了一种能够同时去除植物组织培养时外植体表面和内生菌的方法，该方法能够同时清除杨树等外植体表面及内部的细菌及真菌，使外植体保持充足的活力。

为此，本发明提供了一种同时去除植物组织培养时外植体表面和内生菌的方法，其包括以下步骤：

1、扦插土壤的消毒处理：采用50％的多菌灵对扦插土壤进行消毒处理。

2、扦插枝条的消毒处理：采用含有200mg/L两性霉素B和100mg/L硫酸链霉素的无菌水溶液对扦插枝条进行消毒处理，处理后，对扦插枝条进行顶端封腊处理。

3、外植体的选择和消毒预处理：采用含有100mg/L两性霉素B和50mg/L硫酸链霉素的无菌水溶液对半木质化的新发枝条进行预处理。

4、外植体的溶脂混合液预处理：采用溶脂混合液对外植体进行预处理5-6分钟。

5、外植体的表面灭菌。

(1)外植体的酒精灭菌处理。

(2)外植体的次氯酸钠灭菌处理。

(3)无菌水冲洗。

6、外植体的接种。

7、外植体的培养。

其中所述溶脂混合液为0.1％的吐温20和10％的乙酸乙酯的水溶液。

在本发明优选的实施方案中，扦插土壤的消毒处理为用50％的多菌灵，以30-40g/m3的用量与扦插土壤拌匀，装入塑料袋，密闭，5天后打开，阳光下晾晒2-3天。

在本发明优选的实施方案中，扦插枝条的消毒处理为将冬眠的穗条清洗后，剪成15cm长度，浸入含有200mg/L两性霉素B和100mg/L硫酸链霉素的无菌水溶液中，处理24小时后，进行顶端封腊处理，处理后扦插到营养钵中，移入温室内进行培养。