[发明专利]一种检测母乳中低聚糖的方法

说明书

本发明涉及一种检测母乳中低聚糖的方法，包括对母乳样品进行前处理的步骤，所述前处理具体为：取母乳样品，离心除去上层脂肪，取下层液体并加入醇类溶剂，于﹣40℃～﹣100℃冷冻5‑15min后，离心，取上清液，即得；本发明还提供了采用液质法对前处理后的母乳中的低聚糖进行定性和定量检测的方法；本发明建立起了一种非还原母乳液质联用同时检测母乳中多种低聚糖的方法，具有前处理简单、快速、有效的优势，质谱采用Q Exactive检测器，确定了液相梯度洗脱的参数和质谱检测的参数，给出了非还原母乳低聚糖在正离子模式下质谱检测时的离子信息，能够很好地用于母乳低聚糖的定性和定量检测。

技术领域

本发明属于分析检测技术领域，尤其涉及一种检测母乳中低聚糖的方法，更具体地，涉及一种采用液质法检测母乳中低聚糖的方法。

背景技术

母乳低聚糖(human milk oligosaccharides，HMO)是人类母乳中仅次于乳糖和脂肪的第3大组分，在初乳中含量高达22～23g/L，成熟乳中为12～13g/L。HMO具重要的生物学功能，不仅具有抵御肠道病原微生物感染的功能，还有维持肠道微生态平衡的作用。母乳成分是婴幼儿奶粉制备的黄金标准，因此建立母乳低聚糖的检测方法，是分析母乳成分进而开发更加营养健康的婴幼儿奶粉的必要前提。

目前，母乳低聚糖的检测方法主要有四种：离子色谱、高效液相色谱、液质联用、毛细管电泳色谱。各种方法具体如下：

1)液质联用若配有飞行时间检测器和相应的色谱柱(多孔石墨碳色谱柱较多)可以检测到多达300种母乳低聚糖；但液质联用检测母乳需进行较为复杂的预处理(Tottenet al.,Rapid-throughput glycomics applied to human milk oligosaccharideprofiling for large human studies,2014,Journal,406(Issue),7925-7935)：加水离心脱脂→加乙醇脱蛋白→用NaBH₄还原→【石墨碳固定相萃取：去离子水水洗脱盐→洗脱(20％乙腈水溶液，40％乙腈和0.05％三氟乙酸溶液)】→冷冻干燥→去离子水溶解→液质联用检测。

2)毛细管电泳色谱若配有荧光检测器，也可同时分离多种母乳低聚糖的同分异构体，若使用UV检测器，只能检测部分低聚糖，例如唾液酸相关的低聚糖。毛细管电泳色谱母乳处理如下(Albrecht et al.,CE-LIF-MS n profiling of oligosaccharides in humanmilk and feces of breast-fed babies,2010,Journal,31(Issue),1264–1273)：加水离心脱脂→加乙醇脱蛋白→【石墨碳固定相萃取：去离子水水洗脱盐→洗脱(20％乙腈水溶液，40％乙腈和0.05％三氟乙酸溶液)】→9-氨基芘-1,4,6-三磺酸三钠盐衍生(过夜)→毛细电泳色谱检测。

3)单独使用离子色谱、液相和质谱只能检测部分母乳低聚糖。

从检测结果看，与毛细管电泳色谱、离子色谱，以及单独使用液相或质谱相比，液质联用法可以检测出较多的HMO种类，但是液质联用检测HMO存在以下问题：

1)样品前处理步骤较为复杂，易导致偶然误差增加。前处理取样量仅为50μL，样品在脱脂、脱蛋白后要经过还原、固相萃取、冷冻干燥、复溶等步骤。固相萃取过程中，需经过不同的洗脱液洗脱，易产生洗脱不彻底而导致样品损失；冷冻干燥过程中或干燥后打开密封管时，由于存在真空也易导致样品损失。由于取样量较少，且其中的HMO含量仅为1％左右，因此易导致较大的偶然误差。

2)质谱所用的检测器多为飞行时间(Time of Flight,TOF)检测器，尽管TOF应用的范围较广，但是并不代表最先进的质谱检测器。

Q Exactive检测器可以在很多方面替代TOF，很多实验室采购了Q Exactive检测器，但目前为止并没有关于采用Q Exactive检测母乳低聚糖的相关报道。

发明内容