[发明专利]一种大鼠脑微血管内皮细胞分离及培养方法

权利要求书

1.一种大鼠脑微血管内皮细胞分离及培养方法，其特征在于，包括步骤：(a)大鼠颈椎脱臼处死，消毒并断头置于玻璃培养皿中，打开颅腔后取出全脑；(b)在无菌条件下，剥离解剖去除小脑、间脑以及去除软脑膜和脑膜大血管等，保留大脑皮质；(c)通过机械酶消化法，并结合连续密度梯度离心法获得纯度较高的脑微血管片段；(d)将纯化的脑微血管片段铺置特制的细胞培养皿，并使用两种不同的培养基分离培养脑微血管内皮细胞。

2.根据权利要求1所述的大鼠脑微血管内皮细胞分离及培养方法，其特征在于，所述的大鼠为25-50g，2-3周龄的SD大鼠。

3.根据权利要求1所述的大鼠脑微血管内皮细胞分离及培养方法，其特征在于，所述步骤c中机械酶消化法是将剥离干净的大脑皮质剪碎成约1mm³大小，加入混合酶液I，混匀，37℃水浴消化1-1.5h；1000×g室温离心8min，去上清液；沉淀中加入一定浓度的BSA重悬浮，充分混匀，1000×g 4℃离心20min，去上清；沉淀加入4ml混合酶液II重悬浮，混匀，37℃水浴消化0.5-1h；700×g室温离心6min，去上清液；所述的混合酶液I是0.05-0.1％II型胶原酶，0.025-0.05％IV型胶原酶，200-400U DNaseI，所述的BSA浓度为15-30％，所述的混合酶液II是0.05-0.1％的胶原酶/分散酶，0.05-0.1％I型胶原酶，100-300UDNaseI。

4.根据权利要求1所述的大鼠脑微血管内皮细胞分离及培养方法，其特征在于，所述步骤c中连续密度梯度离心法获得纯度较高的脑微血管片段是通过将消化后离心的沉淀重悬浮，铺于经离心形成连续梯度的12ml 30-50％Percoll(25000×g，60min，4℃)，1000×g，4℃离心10min，吸取中间白黄色的层面，用DMEM漂洗两次(离心1000×rpm，6min，室温)，去上清液。

5.根据权利要求1所述的大鼠脑微血管内皮细胞分离及培养方法，其特征在 于，所述步骤d中将纯化的脑微血管片段铺置特制的细胞培养皿，所述细胞培养皿是用含5％的大鼠血清37℃孵育过夜所制备的。

6.根据权利要求1所述的大鼠脑微血管内皮细胞分离及培养方法，其特征在于，所述步骤d中使用两种不同的培养基分离培养脑微血管内皮细胞为离心沉淀加入DMEM完全培养液(10-20％FBS，2-6ug/mL嘌呤霉素)重悬浮，接种于特殊制备的细胞培养皿中，置于37℃、5％CO₂培养箱内静置培养24h后更换混合培养基，随后隔天换液；所述混合培养基为含5％-10％的大鼠血清，10-20％FBS，10-100μg/mL牛垂体和下丘脑提取物，1ng/mL bFGF以及RPMI1640、DMEM/F12(1∶1)的基础培养基。