[发明专利]细粒棘球绦虫谷氧还蛋白‑1的应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及细粒棘球绦虫谷氧还蛋白-1的应用。

背景技术

细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)属带科(Taeniidae)棘球属(Echinococcus)，其中绦期幼虫寄生于动物和人的肝、肺及其他器官内所引起细粒棘球蚴病，又称囊性包虫病，是一种人兽共患病，主要寄生在人和家畜等多种哺乳动物体内。90％以上的细粒棘球蚴包囊生长于宿主的肝脏、肺脏或者同时生长于肝肺。细粒棘球蚴病呈世界性分布，引起一系列的经济和公共卫生问题。在一些流行地区，其感染率可高达5-10％，死亡率高达2-4％。据估计，全球人囊性棘球蚴病每年至少损失1-3.6百万伤残调整生命年(DALYs)，而动物囊性棘球蚴病每年造成的经济损失至少为20亿美元。因此，世界卫生组织已经把棘球蚴病列为《被忽视的热带疾病》，作为其2008-2015年重点防治计划。

目前，细粒棘球蚴病免疫诊断的研究主要集中在粗囊液抗原上，但是其成分复杂，具有难以大量提纯、抗原来源不稳定、成本高、诊断特异性低等缺陷。缺乏标准有效的特异性重组抗原是细粒棘球蚴病免疫诊断中的一个尚未解决的难题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供细粒棘球绦虫谷氧还蛋白-1(Eg-Grx1)的应用，使其能够能被自然感染细粒棘球蚴病的绵羊阳性血清识别，具有良好的免疫原性，并具有较高的特异性和灵敏度，减少与其他带科绦虫病阳性血清的交叉反应。

谷氧还蛋白(glutaredoxin，Grx)，又称巯基转移酶(thioltmnsferase)，是巯基-二硫键氧化还原酶家族的重要组分。谷氧还蛋白家族与硫氧还蛋白家族一同维持着有机体内氧化还原的平衡，是参与蛋白质的巯基氧化还原态调节的两个重要系统。Grx以GSH作为直接电子供体，NADPH作为原始电子供体，调节细胞含巯基(主要由半胱氨酸提供)蛋白的氧化还原状态，在细胞信号转导过程中发挥重要作用。

目前，关于谷氧还蛋白的研究主要集中在锥虫和疟原虫上，疟原虫Grx1(Pf-Grx1)被定位于细胞质内，具有HEDS活性和减少核糖核苷酸还原酶等特性。Tripathi等研究发现Pf-Grx1能耐高温、耐变性剂以及耐PH变化的特点。Marquez等克隆表达出布氏锥虫的Grx蛋白，发现其在寄生虫的氧化还原新陈代谢中发挥重要作用。但是，寄生虫上关于谷氧还蛋白的报道比较少见。因此，本发明对细粒棘球绦虫谷氧还蛋白-1(Eg-Grx1)进行了生物信息学分析，并通过反转录表达出rEg-Grx1蛋白，制备出抗rEg-Grx1的多克隆抗体，对该蛋白进行免疫印迹分析表明其可被自然感染细粒棘球蚴病的绵羊阳性血清识别，具有良好的免疫原性，利用rEg-Grx1蛋白建立细粒棘球蚴病间接ELISA诊断方法，为细粒棘球蚴病的防控提供监测手段。

因此，本发明提出了细粒棘球绦虫谷氧还蛋白-1在制备检测细粒棘球蚴病的免疫抗原和/或试剂盒中的应用。

其中，作为优选，所述试剂盒为ELISA检测试剂盒或免疫印迹检测试剂盒。

同时，本发明还提供了一种检测细粒棘球蚴病的ELISA检测试剂盒，包括细粒棘球绦虫谷氧还蛋白-1(作为抗原进行包被)和ELISA检测试剂盒常规组分。所述试剂盒依据间接ELISA检测原理。

作为优选，所述ELISA检测试剂盒常规组分包括抗原包被液、酶标板、封闭液、HRP标记的二抗和TMB底物。

进一步优选地，所述封闭液为5％脱脂奶粉；所述HRP标记的二抗为HRP标记的山羊或绵羊抗兔二抗。

在具体的ELISA检测过程中，抗原包被最佳条件是4℃过夜，抗原最佳浓度为1.6μg/每孔，最佳血清稀释浓度为1:320，最佳封闭液和封闭条件是5％脱脂奶粉37℃封闭1h，血清孵育最佳时间是37℃1.5h，二抗孵育最佳时间是37℃1h，二抗最佳稀释浓度为1:3000时，底物显色的最佳条件是37℃15min，在以上条件下，测得阴阳性血清的P/N值为3.04

作为优选，所述ELISA检测试剂盒常规组分还包括显色反应终止液H₂SO₄、洗涤液PBST和稀释液PBS。