[发明专利]一种检测霉变烟叶中12种霉菌毒素浓度的方法

说明书

技术领域

本发明属于霉变烟叶中霉菌毒素成分分析测定技术领域，具体涉及一种采用液相色谱-串联质谱法检测霉变烟叶中12种霉菌毒素浓度的方法。

背景技术

烟叶在复烤后的储藏、发酵和陈化统称为醇化过程，醇化过程是卷烟生产的重要环节，直接影响卷烟的质量。在醇化过程中，常常有烟叶霉变现象发生，霉变后烟叶会长毛、变青黑、发粘、变稀、发臭等，导致大量的烟叶成为垃圾，给烟草企业造成较大的经济损失。烟叶霉变主要是微生物类发酵引起，其中霉菌毒素是真菌的次生代谢产物，可对哺乳动物产生急性或慢性毒性，部分已被证实具有致癌、致畸、致细胞突变的“三致”作用。

因此，分析霉变烟叶中霉菌毒素含量的情况，有助于探索在此过程中真菌生长的变化规律，为有效防控微生物生长提供数据支持，现有检测方法分为快速筛选法和确证法两大类。快速筛选法主要是酶联免疫法，此方法具有存在一定的假阳性，不能作为最终的确证方法。真菌毒素检测的确证方法有薄层层析色谱法（TIC）、液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）以及液相串联质谱法（LC-MS/MS）等。LC-MS/MS可同时提供目标化合物的保留时间和分子结构信息，具有杂质影响小，对净化要求低、灵敏度高、适合多组分同时分析等特点。

为此，基于LC-MS/MS在定性定量的优势，探索开发采用液相色谱-串联三重四级杆质谱仪测定霉变烟叶中霉菌毒素含量的方法，对准确检测霉变烟叶中的霉菌毒素具有重要意义。

发明内容

为准确检测霉变烟叶中霉菌毒素的含量，本发明提供一种检测霉变烟叶中12种霉菌毒素浓度的方法，以准确定性定量检测霉变烟叶中的12种霉菌毒素浓度。

本发明通过以下技术方案实现：一种检测霉变烟叶中12种霉菌毒素浓度的方法，经过下列各步骤：

（1）制备12种霉菌毒素混合母液：分别称取桔青霉毒素、脱氧血腐镰刀菌醇、柄曲霉素、黄绿青霉素、T-2毒素、黄曲霉毒素M1、伏马毒素B2、伏马毒素B1、黄曲霉毒素混标的标准品于10mL容量瓶中，各采用甲醇溶解并定容，然后各分别移取1 mL上述12种溶液于25 mL容量瓶中，采用甲醇定容，得到12种霉菌毒素混合母液；取1ml标准溶液于25mL容量瓶中，并采用甲醇定容，得到内标溶液；

（2）准备标准工作溶液：分别移取0.02 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.50 mL和1.0 mL步骤（1）所得12种霉菌毒素混合母液于10 mL容量瓶中，加入内标溶液1.0mL，采用体积浓度为0.1%的甲酸水溶液进行定容，得到标准工作溶液系列；

（3）制备样品溶液：称取1.0 g磨碎的待测霉变烟叶样品，置于50 mL离心管中，加入20 mL提取溶剂A，涡旋1min，振荡提取60min，再以5000rpm的转速离心5min后，将上清液转移到另一个50mL离心管中，然后向残渣中加入20mL提取溶剂B，涡旋1min，继续振荡提取30min，然后在5000rpm的转速下离心5min，合并第一次上清液；在合并两次提取的上清液时，可能会产生沉淀，因此，再次在5000rpm的转速离心5 min，取980μL终提取液（上清液）于样品瓶中，加入20μL内标溶液，充分混匀，经0.22μm过滤膜后得到样品溶液；

（4）进行液相色谱-串联三重四级杆质谱分析：采用液相色谱-串联三重四级杆质谱分析仪，分析检测的液相色谱、质谱条件如下：

色谱柱为Waters Acquity BEH C18（1.7μm，2.1mm×100mm），柱温：25℃；流动相A为体积浓度0.1%的甲酸水溶液，流动相B为体积浓度0.1%的甲酸甲醇溶液（溶质为甲酸，溶剂为甲醇）；梯度洗脱，条件为0 ~ 0.5 min：70% A，0.5 ~ 10 min：70% A ~ 0% A，10.0 ~10.1 min：0% A~70% A，10.1 ~14 min：70% A；流速：0.2 mL/min，进样体积5 μL；

离子源：采用电喷雾电离源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测MRM；电喷雾电压：500 V；干燥气温度：325℃；干燥气流量：6 L/min；鞘气温度：380℃；鞘气流量：10 L/min；毛细管电压：4000 V；