[发明专利]体外培养富集CD8+T细胞的方法

权利要求书

1.一种体外培养富集人CD8+T细胞的方法，包括以下步骤：

(1)抽取人全血5～100ml并对其进行处理以获得分离的外周血单个核细胞；

(2)对所述的分离的外周血单个核细胞进行分选，获得CD4+T细胞∶CD8+T细胞比率为1：1～1：5的T细胞悬液；

(3)将所述的T细胞悬液接种到细胞培养板中的AIM-V无血清细胞培养基里，在37℃、5％CO2和100％湿度条件下培养7～14天获得目的细胞悬液，其中所述的培养基中还分别添加有终浓度为300U/ml的IL-2、终浓度为5～10μg/ml的CD3抗体以及终浓度为5～10μg/ml的CD28抗体；

其特征在于，所述的细胞培养板是预包被有CD3抗体和CD28抗体的细胞培养板，所述的预包被有CD3抗体和CD28抗体的细胞培养板是通过下述方法制备的：

将含有终浓度为5μg/ml的CD3抗体和终浓度为5μg/ml的CD28抗体的PBS缓冲液按照对于96孔板以100μl/孔或对于24孔板以500μl/孔的量加入到细胞培养板后4℃孵育过夜。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的T细胞悬液的接种密度为5×10⁵细胞/ml。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的处理为：

先将新鲜采集的外周血用冷却的无菌磷酸盐缓冲液稀释一倍，将稀释的血样以1：1～1：5的比例加入到淋巴细胞分离液中，在25℃用水平离心机于700g离心20分钟，吸出第二层淋巴细胞层至新的无菌离心管中，用等体积的磷酸盐缓冲液稀释后于25℃以800g的离心力离心10分钟；弃掉上清，用无血清RPMI1640重悬，在25℃下500g离心5分钟，弃掉上清，重悬，加入含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基清洗，于25℃下500g离心5分钟，弃掉上清后用含10％FBS的RPMI-1640培养基重悬，取适量重悬液于血球计数板上进行细胞计数，并用含10％血清的RPMI-1640培养基将细胞液调整至2.5×10⁶细胞/ml的最终密度。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的分选是通过分选柱实现的。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的分选是通过将分选柱放置在强磁场中实现的。