[发明专利]一种红外线‑固定化酶协同酶解蛋白质的方法

说明书

技术领域

本发明涉及属于生物化工领域，具体涉及一种蛋白质酶解方法，尤其涉及一种红外线-固定化酶协同酶解蛋白质的方法。

背景技术

蛋白质组学是一门后基因组学时代兴起的学科，它本质上是从蛋白质水平上对基因和细胞进行大规模直观的鉴定，其广泛应用于癌症的识别与治疗、疾病的预测等。蛋白质的酶解是蛋白质组学研究中蛋白质分析鉴定的关键步骤。传统的酶解过程是基于溶液酶解法，通常是将自由酶与待测样品以质量比1:50的比例混合后，在37℃下反应12-24h。这种方法存在酶解时间较长、容易产生酶的自身酶解、酶无法回收利用等问题。为了克服这些缺点，科学家对酶解方法进行了大量的研究。

目前，提高酶解效率的方法主要是采用物理化学方法和固定化酶技术对酶解过程进行促进。常用的物理化学方法包括超声波、微波、红外线等。作为一种重要的电磁波形式，红外辐射最为广泛的应用在于提供加热源。最近，采用红外线辅助自由酶酶解蛋白的工作已有报道。相对于传统的水浴加热法而言，使用红外线除了可以提供热量来源，更重要的是红外线能够激发分子内的振动，从而促使蛋白质酶切位点的暴露，提高酶解效率。然而，红外线在辅助酶解的过程中，由于其持续激发分子振动，会使被辐射的物体产生热量。当温度过高时，会导致酶失活，影响酶解效果。因此，在使用红外线辅助自由酶酶解时，需要采用外源制冷装置对反应体系的温度进行控制。这大大增加了装置的复杂程度，且浪费了能源。

固定化酶技术是将蛋白水解酶固定在载体材料上，在一定温度下与蛋白质溶液进行酶解反应，该技术通过增加酶分子结构的刚性从而显著提高酶的耐热性。但酶分子被固定后，移动性变差，同时载体在酶与待测蛋白质样品之间形成的空间位阻也限制了酶与底物的接触。因此，若能在酶解过程中，将待测蛋白质样品富集于固定化酶周围，并且提高酶与待测蛋白质样品酶切位点的接触频率，则能极大程度加速酶解反应，缩短酶解时间。考虑到红外线辅助酶解的优异效果，以及固定化酶技术的优势，若能将两种技术结合起来，且不采用冷却装置，则能为蛋白质酶解提供一种新型的快速高效方法。

发明内容

鉴于现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种红外线-固定化酶协同酶解蛋白质的方法，本发明利用温敏性微球为固定化酶载体，将红外线技术与温敏固定化酶相结合对蛋白质进行协同酶解处理，且在酶解过程中不需要任何外源加热和降温设备。本发明步骤简单、操作方便，利用红外线对反应体系进行升温并促进蛋白酶切位点的暴露，可有效增加酶切位点与酶的作用频率，从而显著提高酶解效率；同时，在体系升温过程中，温敏固定化酶微球吸收体系热量并发生相转变，表现出疏水性质。疏水的微球能有效保持酶活性，并通过疏水相互作用富集待测蛋白质样品，增加酶与底物的接触几率。这种红外线与固定化酶协同酶解作用，可以更好地实现蛋白质的高效酶解，有助于批量蛋白质的高通量酶解和鉴定。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种蛋白质酶解的方法，其包括：在红外线辐射下利用温敏固定化酶微球对蛋白质进行酶解。

本发明是以温敏性微球为固定化酶载体，通过红外线辐射来调节温敏固定化酶微球的亲疏水性质，进而控制蛋白质酶解过程。

本发明采用将红外线-温敏固定化酶微球相结合用于蛋白质酶解，即本发明提供了关于红外线-温敏固定化酶微球相结合在蛋白质酶解中的用途。

本发明利用红外线辐射调节温敏固定化酶微球亲疏水性的原理为：在红外线辐射下，当温度高于温敏固定化酶微球的临界相转变温度时，微球呈疏水性，能够富集待测蛋白质样品的同时对其进行酶解，在温度低于温敏固定化酶微球的临界相转变温度时，停止酶解并释放肽段，从而提高酶解效率和样品肽段的检出率。

本发明采用温敏性微球，相比纳米级别载体，其具有更快的沉降速率，无需使用纳米载体体系在分离过程中所要求的高转速、长时间等苛刻的分离条件，可避免由于长时间离心时，离心机发热对固定化酶活性的影响；相比采用其它载体，例如磁性颗粒、聚合物膜、介孔材料、二氧化硅、氧化石墨烯材料等，其可以实现通过温度来调节温敏固定化酶微球的亲疏水性质，从而大大提高酶解的效率以及后续蛋白质鉴定的准确度，提高样品肽段的检出率。

本发明采用红外线技术，在酶解过程不需要任何外源加热和降温设备，充分利用了红外线对反应体系进行升温并促进蛋白酶切位点的暴露，其与温敏固化酶微球二者具有协同增效作用，从而实现了蛋白质的高效酶解，有助于批量蛋白质的高通量酶解和鉴定。

根据本发明，所述蛋白质酶解的方法，其包括以下步骤：

(1)将待酶解的蛋白质样品进行热变性处理；