[发明专利]血浆中氨基酸分析用内标液、内标物质及血浆中氨基酸的定量方法

说明书

本申请是申请号为201280035466.4(国际申请号为PCT/JP2012/068302)、中国国家阶段进入日为2014年1月17日(国际申请日为2012年7月19日)、发明名称为“血浆中氨基酸分析用标准液”的中国发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及氨基酸分析用标准液，特别是涉及外标物或内标物用途的标准液、以及使用了该标准液的氨基酸定量方法。

背景技术

近年来，已知生物体内的代谢物不仅受遗传因素的影响，还大大受到环境因素的影响，这些代谢物的分析与基因、蛋白质的分析同样地被作为疾病诊断和健康状态的指标而受到关注。其中，氨基酸、胺等氨基酸相关化合物是最广泛存在的代谢物组之一(例如非专利文献1)，自古以来就对其进行定量分析，并且开发出各种各样的分析方法。

另一方面，在定量分析中，一般使用标准曲线法，该标准曲线法通常对覆盖着分析对象化合物的测定点的2种以上浓度的标准物质进行分析来制作标准曲线。在利用这样的标准曲线法的定量分析中，使用已知浓度的外标物预先求出浓度与信号(signal，具体来说表示为峰面积、峰高等)的相关关系，根据其中所得到的信息(即标准曲线)求出检测样品中的浓度。因此，在使用标准曲线法的定量分析中以由外标(基准)得到的标准曲线作为基准，因而为了进行高精度的解析，定量用的标准品极为重要。并且，为了高精度地进行利用标准曲线法的定量分析，准备多个不同浓度系列的标准品，实际测定这些标准品来制作标准曲线，并且检测样品中的测定对象的浓度处于标准曲线制作中使用的标准品的浓度之间对于进行高精度定量而言是重要的。具体来说，如果检测样品中的对象的浓度为50μM(μmol/l)的样本，则优选使用从25μM到75μM的标准品。进一步，此时的标准品的校准点(测定点)的范围窄时更容易确保浓度与信号的线性，因而是优选的。更具体来说，相比于在1μM到100μM间取校准点，优选在25μM至75μM间取校准点。

然而，生物体内的氨基酸(氨基酸相关化合物)的种类较多。例如，在SRL公司的氨基酸分析的检查项目中，举出了39种氨基酸相关化合物作为分析对象(例如非专利文献2)。并且，已知生物体内的氨基酸浓度因氨基酸的种类而大大不同，浓度高的氨基酸和浓度低的氨基酸之间存在100倍左右(2数量级)的浓度差。因此，使用已有的混合标准液[例如，氨基酸混合标准液AN-II型(代码编号：015-14461、011-14463)、B型(代码编号：016-08641、012-08643)、H型(代码编号：013-08391、019-08393)等(均由和光纯药工业株式会社销售)]进行分析时，存在需要根据各氨基酸相关化合物的浓度范围对标准物质或检测样品进行稀释等需要花费工夫进行准备的问题。

另一方面，已有关于针对人血浆中的氨基酸的参考标准物质的报告(非专利文献3)，该报告中的标准物质为由非特定多数的100名美国男女得到的血浆混合而成的血浆池，因此无法避免批次间的浓度值的偏差。另外，将其用作标准液进行氨基酸测定时，该标准物质中含有的各种氨基酸的浓度为100人的平均值，因而样本的氨基酸浓度超过平均值时，该浓度脱离标准曲线的范围，在测定精度方面欠缺可靠性。进一步，该标准物质含有氨基酸以外的各种生物体物质，因此无法否定因这些物质对测定值产生影响的可能性，在用作用于高精度定量分析的标准物质时存在问题。

因此，期望开发出一种标准物质，其不需要根据所测定的氨基酸的种类调整浓度，使用适当稀释1种溶液而成的物质就能够制作可以对来自生物体的样本中的各种氨基酸能够进行高精度定量的标准曲线。

进一步，使用标准曲线法的定量分析法中有所谓的外标法和内标法等，而对于内标物质来说，与外标物质一样通过匹配检测样品的特性来设计标准物质，从而可以提高定量精度。特别是将质谱仪作为检测器时，样品中的基质效应的影响较大，使用内标物质在高精度测定方面非常重要。

关于使用该内标法的氨基酸测定已有多项研究报道(例如非专利文献4、5)，以往的内标物质的浓度与信号的线性差，使用这些内标物质时具有氨基酸的测定精度不良等问题。因此，期望开发克服了这类问题的内标物质。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO2003/069328

非专利文献

非专利文献1：B.D.Bennett,E.H.Kimball,M.Gao,R.Osterhout,S.J.Van Dien and J.D.Rabinowitz,Nat.Chem.Biol.,5,593-599(2009).