[发明专利]一种应用转肽酶SortaseA修饰蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种应用转肽酶Sortase A修饰蛋白的方法，属于基因工程领域。

背景技术

Sortase A是一类介导革兰氏阳性菌细胞壁锚定蛋白与细胞壁共价结合的转肽酶，近些年其在生物技术领域的应用吸引了越来越多的关注。自从2004年首次报道应用Sortase A作为一种蛋白质或多肽的连接工具以来，Sortase A参与的连接反应迅速成为一个研究热点，已被广泛应用于生物化学、蛋白质组学、生物医药以及生物工程技术等领域。但是目前Sortase A的应用依然存在以下的几个问题：(1)在大肠杆菌中Sortase A的表达水平很低；(2)表达所得Sortase A需要经过菌体破壁、分离纯化等多个步骤，繁琐的工艺和较高的成本也限制了Sortase A的应用；(3)介导蛋白修饰的Sortase A被直接添加至反应体系中，反应结束后Sortase A不易分离无法重复使用，且会给产物纯化带来困难；(4)固定于树脂上的Sortase A虽利于产物纯化，但其催化蛋白修饰的反应产率较低。因此，如何能更有效、更简便的实现Sortase A在蛋白修饰中的应用已成为目前急需解决的关键问题。

发明内容

为了解决Sortase A在蛋白修饰应用中存在的问题，本发明利用可以特异性吸附转肽酶Sortase A的磁珠，将Sortase A一步固定至磁珠上，用于催化蛋白或短肽连接、修饰反应。

所述转肽酶Sortase A可以是微生物发酵得到的粗酶液或者纯酶。

在本发明的一种实施方式中，以磁珠固定Sortase A时，调整两者用量比例使磁珠达到吸附饱和。

在本发明的一种实施方式中，将C端带有His₆标签的Sortase A的酶液与His Tag标签蛋白亲和镍磁珠进行结合，制备可用于催化反应的Sortase A结合磁珠。

在本发明的一种实施方式中，将3mL以上活力为90.2mg/L的酶液与磁珠以体积比为6:1-30:1的比例混合，于4-25℃结合30min以上进行固定化，酶液的pH调整为pH值5.0-8.0。

在本发明的一种实施方式中，所述磁珠可采用His Tag标签蛋白螯合磁珠(海狸纳米科技有限公司，产品货号：70501-100)。

所述蛋白或短肽连接、修饰反应包括：蛋白与蛋白大分子之间的连接反应、蛋白与小分子底物(例如，荧光素标签分子、Biotin等生物亲和标签、特异性化学标记基团等)之间的连接反应、蛋白与树脂之间的连接反应、蛋白自身环化反应、短肽与蛋白大分子之间的连接反应、短肽与短肽之间的连接反应、短肽与树脂之间的连接反应、短肽自身环化反应。

在本发明的一种实施方式中，所述酶液的获得，是以pET22a为表达载体，并利用载体上自带的PelB信号肽构建携带编码Sortase A的基因(SEQ ID NO.1)的重组表达载体，将重组表达载体与分子伴侣pG-Tf2质粒共同转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)得到重组菌，在TB培养基中，30℃诱导培养重组菌36h后获得90.2mg/L的胞外C端带有His₆标签的Sortase A酶液。

本发明所得磁珠的酶活可达318.2U/200μL磁珠；磁珠与Sortase A结合后颗粒平均直径由19μm增加到34μm；粗酶液中的Sortase A可以完全被磁珠结合，且磁珠仅仅特异性结合C端带有His₆标签的Sortase A。利用上述制备的Sortase A结合磁珠直接催化短肽与短肽之间的转肽连接反应(37℃，12h)，并将反应后的磁珠洗涤回收后循环使用(5次)，检测每次催化反应所得产率。结果表明，Sortase A结合磁珠催化的转肽连接反应其特征在于：最高产率(81.8％)与游离酶催化产率相比(76.8％)提高了5.5％，维持大于75％的产率磁珠可至少循环使用5次以上。

附图说明

图1 Sortase A结合前后磁珠的直径变化检测，(A)初始磁珠：磁珠平均直径(19μm)，(B)Sortase A结合后磁珠：磁珠平均直径(34μm)。

图2磁珠与粗酶液中的Sortase A结合情况的SDS-Page检测；1、发酵上清，2、磁珠吸附后发酵上清，3、10mM咪唑磁珠洗脱结果；4、500mM咪唑磁珠洗脱结果。

图3 Sortase A结合磁珠催化的短肽与短肽之间的转肽连接反应产物的HPLC检测。