[发明专利]一种构建大肠杆菌高效分泌表达转肽酶SortaseA的方法

说明书

本发明公开了一种构建大肠杆菌高效分泌表达转肽酶SortaseA的方法，属于基因工程领域。本发明成功实现了SortaseA在大肠杆菌中的高效分泌表达，解决了目前已有报道中该酶无法分泌表达且胞内表达水平较低的问题。在摇瓶水平，所得SortaseA产量可达90.2mg/L，胞外酶活水平可达34.2U/mL；为后续SortaseA的工业化生产奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种构建大肠杆菌高效分泌表达转肽酶Sortase A的方法，属于基因工程领域。

背景技术

Sortase A是一类介导革兰氏阳性菌细胞壁锚定蛋白与细胞壁共价结合的转肽酶，近些年其在生物技术领域的应用吸引了越来越多的关注。自从2004年首次报道应用Sortase A作为一种蛋白质或多肽的连接工具以来，Sortase A参与的连接反应迅速成为一个研究热点，已被广泛应用于生物化学、蛋白质组学、生物医药以及生物工程技术等领域。但到目前为止，关于Sortase A高效表达和工业化生产的研究却很少，酶的表达方式仍主要局限于大肠杆菌的胞内表达。Sortase A的胞内表达存在以下几个主要的缺陷：(1)产率较低：在已有的报道中，最高产率仅为76.9mg/L；(2)胞内表达的Sortase A易在菌体内形成包涵体，且纯化前还需要经过耗时且成本较高的细胞破碎步骤。因此，构建Sortase A的大肠杆菌高效分泌表达菌株能解决该酶胞内表达时存在的问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题首先是提供一种高效分泌表达Sortase A(转肽酶)的重组大肠杆菌，用于实现Sortase A的高效生产。

所述重组大肠杆菌是以pET22a为表达载体，并利用载体上自带的PelB信号肽构建携带编码Sortase A的基因的重组表达载体，将重组表达载体与分子伴侣pG-Tf2质粒共同转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。

在本发明的一种实施方式中，所述编码Sortase A的基因来源于金黄色葡萄球菌。

在本发明的一种实施方式中，所述编码Sortase A的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

本发明还提供一种应用所述重组大肠杆菌分泌表达Sortase A的方法，以2-5％的接种量将培养好的种子接种至TB培养基中；采用的发酵条件为：发酵温度28-30℃、诱导培养24-36h、诱导剂IPTG浓度100mM/L、诱导时机OD₆₀₀＝0.6-0.8。所述TB培养基的配方是：蛋白胨12.0g/L，酵母粉24.0g/L，甘油4.0g/L，KH₂PO₄ 2.31g/L、K₂HPO₄ 12.54g/L，pH 7.0。

本发明成功实现了Sortase A在大肠杆菌中的高效生产，解决了目前已有报道中该酶表达水平较低的问题，在7L发酵罐中进行发酵所得Sortase A产量可达295.2mg/L，单位质量菌体酶活可达4845U/mg。

附图说明

图1不同信号肽介导的Sortase A分泌表达效果比较(黑色柱状图：Sortase A的胞外酶活；白色柱状图：Sortase A的分泌表达量)

具体实施方式

具体实施方式