[发明专利]宿主外周血单个核细胞和T细胞的癌症DNA甲基化标志物

说明书

本发明发现了癌症在宿主的T细胞和外周血单个核细胞(PBMC)的DNA中具有DNA甲基化标志物。本发明公开了源自PBMC的DNA的CG IDs，通过上述CG IDs在PBMC或T细胞的DNA中的甲基化水平预测肝细胞癌(HCC)临床进展分期和慢性肝炎。本发明还公开了，一种通过使用本发明所识别的CG IDs来预测HCC的试剂盒，以及焦磷酸测序DNA甲基化实验、受试者工作特征(ROC)实验、惩罚回归实验和层级聚类分析在预测HCC中的应用。本领域任一技术人员均可以使用本发明来获得用于任何癌症和任何癌症临床进展分期的DNA甲基化标志物。本发明描述的DNA甲基化标志物(CG IDs)将用于诊断：a.癌症；b.癌症不同临床进展分期；c.正在接受治疗的患者对治疗的反应；d.慢性乙型肝炎或慢性丙型肝炎。

技术领域

本发明涉及人类DNA中的DNA甲基化标志物，特别是分子诊断领域。

背景技术

肝细胞癌(HCC)是世界第五大最常见的癌症(1)，其在亚洲是特别流行的。并且肝细胞癌的发生率在乙型肝炎流行的区域是最高的，这表明其具有可能的因果关系(2)。对高危患者例如慢性肝炎患者的追踪和对由慢性肝炎向HCC转变的早期诊断可以提高治愈率。目前肝细胞癌患者的长期存活率是极低的，因为肝细胞癌几乎都是在中晚期诊断出的。如果提早诊断，肝癌可以被有效地治疗，其治愈率80％。影像诊断的进步改善了HCC的非侵入式检测(3、4)。然而，目前的诊断方法，其包括影像和使用单个蛋白例如α-甲胎蛋白的免疫分析，经常不能提早诊断HCC(2)。该挑战不限于HCC，其它癌症中也同样存在。癌症的分子诊断聚焦于源自肿瘤的组织细胞和生物材料，包括血浆中的肿瘤DNA(5、6)、循环中的肿瘤细胞(7)和肿瘤宿主微环境(8、9)。目前流行并被广泛接受的假设是：驱动癌症发生和进展的分子变化主要在于肿瘤自身，而宿主的相关变化主要发生在肿瘤微环境中。因此，肿瘤微环境中免疫细胞的识别受到了极大的关注(10、11)。

DNA甲基化，DNA的共价修饰，是基因组功能表观调控的主要机理，其在包括HCC(16)在内的肿瘤中(12-15)普遍发生改变。肿瘤DNA甲基化特征性图谱可以区分肿瘤临床进展分期，并可以用作肿瘤分类、预后以及对化疗反应的响应的潜在有力工具(17)。在早期诊断中使用肿瘤DNA甲基化的主要缺陷在于，需要进行侵入式操作以及需要可疑肿瘤的解剖可视化。循环中的肿瘤细胞是肿瘤DNA的非侵入来源，其被用于测量肿瘤抑制基因中的DNA甲基化(18)。低甲基化的HCC细胞的DNA在患者血液中是可以检测到的(19)，并且全基因组重亚硫酸盐测序最近被用于检测来自HCC患者的血浆中的癌细胞的低甲基化DNA(20)。然而，该来源是有限的，特别是在癌症的早期阶段，并且其DNA甲基化图谱和宿主DNA甲基化图谱是混淆的。

宿主免疫-监视在肿瘤发生中通过清除肿瘤细胞和抑制肿瘤生长而起重要的作用，这一想法在一个世纪以前就已经由Paul Ehrlich(21,22)提出了，但随后没有得到支持。然而，由动物和人体临床研究中积累的数据表明宿主的免疫系统在肿瘤发生中通过“免疫编辑”起到重要的作用，其涉及三个阶段：消除、平衡和逃避(23-25)。在人类进展性黑色素瘤(26-31)、食道癌(32)、卵巢癌(33、34)和结肠癌(35-37)的若干临床研究中，肿瘤浸润性细胞毒素CD8+T细胞的存在和较好的预后相关。当循环中的癌细胞在没有临床症状时是可以被检测到时，免疫系统被认为是癌症休眠现象的原因(15，38)。有趣的是，最近的肿瘤DNA甲基化和转录组分析揭示了浸润性淋巴细胞的肿瘤阶段特异性免疫标志物(39、40)。然而，这些标志物代表了肿瘤微环境中的靶免疫细胞，并且这些标志物在早期诊断中的使用需要侵入式操作。肿瘤浸润性免疫细胞代表的仅仅是一小部分外周血细胞(41-44)。白血球和EWAs研究中报道的总体(global)DNA甲基化变化显示了来自膀胱、头和颈、以及卵巢癌中的白血球的DNA甲基化差异，并且这些差异与白细胞分布的差异无关(45)。这些研究主要是为了识别癌症基因中潜在的DNA甲基化变化，其可能用作肿瘤中DNA甲基化变化的替代标志。然而，外周宿主免疫系统能否显示出响应与癌症进展相关的癌症状态的独特的DNA甲基化，尚未得到说明。

发明内容