[发明专利]一种产表阿霉素的基因工程菌及其应用

权利要求书

1.一种产表阿霉素的基因工程菌，其特征在于，其是将含有酮基还原酶基因的重组载体转化波塞链霉菌(Streptomyces peucetius)构建而成，所述酮基还原酶基因的核苷酸序列依次如序列表SEQ ID No:2所示，所述波塞链霉菌为波塞链霉菌(Streptomycespeucetius)ATCC 27952；

所述的波塞链霉菌为基因修饰后破坏dnmV基因的dnmV破坏株，所述dnmV破坏株含有dnmV基因破坏用质粒，所述dnmV基因破坏用质粒的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:28所示。

2.如权利要求1所述的产表阿霉素的基因工程菌，其特征在于，所述dnmV破坏株由包括以下步骤的制备方法制得：

(1)、扩增获得波塞链霉菌(Streptomyces peucetius)的dnmV基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No:27所示；构建包含插入终止密码子的dnmV基因的dnmV基因破坏用质粒，所述dnmV基因破坏用质粒的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:28所示；

(2)、将步骤(1)制得的dnmV基因破坏用质粒与波塞链霉菌接合，选择后获得不产阿霉素的dnmV基因破坏株。

3.如权利要求2所述的产表阿霉素的基因工程菌，其特征在于，步骤(1)中，获得所述插入终止密码子的dnmV基因的方法为重叠PCR法，所述重叠PCR法所使用的引物Dau5-HindIII、dnmV3-84、dnmV5-84和Dau3-XbaI的核苷酸序列依次如序列表SEQ ID No:19～22所示；步骤(2)中，所述接合前包括选择安普霉素抗性株的步骤；或者，所述接合后包括选择安普霉素敏感性菌株的步骤。

4.一种产表阿霉素的基因工程菌的制备方法，其特征在于，其包括以下的步骤：

(1)、扩增获得波塞链霉菌(Streptomyces peucetius)dnmV基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No:27所示；构建包含插入终止密码子的dnmV基因的dnmV基因破坏用质粒，所述dnmV基因破坏用质粒的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:28所示；

(2)、将步骤1制得的dnmV基因破坏用质粒与波塞链霉菌接合，选择后获得不产阿霉素的dnmV基因破坏株；

(3)、制备得到质粒pET22b(+)-E*，所述质粒pET22b(+)-E*的核苷酸序列如序列表SEQID No:31所示；制备得到质粒pSP72-Ter，所述质粒pSP72-Ter的核苷酸序列如序列表SEQID No:32所示；

(4)、得到酮基还原酶基因，所述酮基还原酶基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:2所示；

(5)、将步骤4所得的酮基还原酶基因用NdeI和HindIII双酶切后，插入到步骤3所得质粒pSP72-Ter，得到中间质粒A；

(6)、将步骤5所得的中间质粒A用NdeI和BamHI双酶切后，分别连接到步骤3所得的质粒pET22b(+)-E*上，得到中间质粒B；

(7)、将步骤6所得的中间质粒B用XbaI-BamHI双酶切后，插入质粒Pset152，得到接合转移质粒；所述质粒Pset152的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:33所示；

(8)、将步骤2所得的不产阿霉素的dnmV基因破坏株作为宿主，采用接合转移的方法导入步骤7所得的接合转移质粒，即得产表阿霉素的基因工程菌。

5.如权利要求1-3任一项所述的产表阿霉素的基因工程菌在制备表阿霉素中的应用。

6.一种利用如权利要求1-3任一项所述的产表阿霉素的基因工程菌制备表阿霉素的方法，其特征在于，其包括如下的步骤：

(1)将所述产表阿霉素的基因工程菌接种到发酵培养基，发酵，得发酵液；

(2)将步骤(1)所得的发酵液pH调至1.5～1.8，超声，离心即可。