[发明专利]一种辣椒抗病基因鉴定方法

权利要求书

1.一种辣椒抗疫病基因鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：供试抗疫病辣椒品种和幼苗的准备，搜集来源于不同产地抗疫病的20个辣椒品种种子，每品种取辣椒种子100粒，将其播种于育苗钵基质中，然后放置于温室中进行育苗（20～30℃），待生长至3～4片幼叶时，将其移栽至营养盆中继续进行培养，待再生长至7～8片叶时即获得辣椒壮苗材料；

S2：供试疫病菌株的收集和荧光素标记毒素的制备，辣椒疫病菌株由淮安市农科院辣椒课题组馈赠，将荧光素与所述疫病菌株在培养皿中共浸染40min，然后于25℃光照培养5～6 d后即获得含有荧光标记毒素作接种用的疫病菌株；

S3：用带荧光标记毒素的疫菌离体接种辣椒叶片，从培育的20个品种辣椒幼苗中，每个品种选取10株壮苗，取叶片，采用离体叶片全叶接种法接种含有荧光标记毒素的疫菌（浸菌处理24h），PBS漂洗残留菌液，然后将接种后的辣椒叶片在培养基上培养10d，每品种幼苗设置3个重复实验组；

S4：辣椒抗疫病基因数据库的构建，取上述离体接种并培养10d后的每个供试辣椒品种幼叶，用试剂盒提取辣椒叶片DNA，琼脂糖凝胶电泳进行质量检测，然后委托有关公司进行DNA测序，同时根据上述辣椒品种在荧光显微镜下抗疫菌毒素荧光标记与辣椒抗疫病表现型鉴定结果，通过表型与基因关联分析法确立辣椒抗疫病毒素荧光标记鉴定与辣椒抗疫病基因之间对应关系，将荧光显示抗疫病辣椒品种中所获得的抗疫病相关基因片段登记入Genbank数据库上，从而建成辣椒抗疫病基因数据库；

S5：待检辣椒抗疫病基因的鉴定，提取待检测辣椒植株叶片DNA并委托公司进行测序，然后与S4步骤中建立的辣椒抗疫病基因数据库，在Genbank上通过Blast软件进行DNA序列比对分析，若出现匹配片段，则表明待检辣椒植株含有抗疫病基因即为抗疫病辣椒品种，该鉴定结果准确可靠，简便直观，灵敏快捷。

2.根据权利要求1所述的一种辣椒抗疫病基因鉴定方法，其特征在于，所述荧光标记毒素的制备方法为将荧光素与所得到的辣椒疫病菌株在培养皿中共浸染40min，于25℃光照培养5～6d后即得含荧光标记毒素用于接种的疫病菌株。

3.根据权利要求1所述的一种辣椒抗疫病基因鉴定方法，其特征在于，所述离体叶片全叶接种法是指取辣椒幼苗生长至7～8片叶龄一致的生长良好的完整幼叶，用无菌水进行清洗并将表面水吸干后，将叶片正面朝上放入带有荧光标记毒素疫菌的培养皿中，于25℃相对湿度为75%～85%的恒温箱中进行接种24h，并将接种后叶片在辣椒培养基上培养10d，于第10d观察统计发病情况，同时在荧光显微镜下观察叶片荧光标记现象的有无及强弱，从而建立通过观察毒素荧光标记确定辣椒品种抗疫病性结果的一种快速灵敏鉴定方法。

4.根据权利要求1所述的一种辣椒抗疫病基因鉴定方法，其特征在于，所述辣椒抗疫病DNA数据库的建立与待检测辣椒抗疫病基因鉴定的方法，是根据所述S3鉴定结果，将辣椒抗疫病植株DNA提取测序后片段信息登记入Genbank数据库，即建立辣椒抗疫病DNA数据库，将待检测辣椒品种植株叶片DNA提取并测序后与Genbank上辣椒抗疫病基因数据库运用Blast软件进行序列比对分析，发现匹配DNA片段则表明该辣椒植株或品种含有抗疫病基因即具有抗疫病性能，只需通过数据库网站显示窗口将结果反馈给查询者，即可快捷知道鉴定结果。