[发明专利]嗜肺军团菌荧光定量引物及探针、检测方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及嗜肺军团菌荧光定量引物及探针、检测方法和试剂盒。

背景技术

军团菌病是一种急性细菌性传染病，主要累及肺，亦可导致多系统性损害，临床特征为肺炎伴全身毒血症症状，主要表现为两种类型，一种潜伏期短，无肺炎表现，称庞堤克热；另一种潜伏期长，有肺炎表现，称为肺炎型军团菌病，为军团菌病的主要类型。目前发现军团菌有50多个种属，其中15种为肺炎致病菌，至少20个种属对人体致病，70个血清型。

嗜肺军团菌(Legionella pneumophila，LP)是一种有鞭毛，革兰氏阴性，军团菌属多形态性的短小球杆菌，兼性胞内寄生菌，是引起人类军团菌病的重要病原体。该菌存在于水和土壤中，常经供水系统、溶洞和雾化吸入而引起肺炎型和非肺炎型感染。根据O-抗原的不同，嗜肺军团菌可分为15个血清型，其中血清1型(LP.1)是引起军团菌肺炎的主要病原菌，血清2型和4型也可致肺炎，血清6型(LP.6)常引起庞堤克热。军团菌是社区获得性肺炎的第三大致病菌，重症肺炎的第二大致病菌，军团菌肺炎的病死率10％～15％。肺炎型(重症)主要由嗜肺军团菌(LP，特别是LP1血清型引起，潜伏期2～10天，除呼吸道症状外还有明显的多器官损害，头痛、畏寒、发热、伴消化道及神经系统症状及体征，致死率高。非肺炎型(庞蒂亚克热)潜伏期短，症状轻，以乏力、肌痛、发热、干咳常见，发病率高，但无死亡。CDC报道该菌引起的医院感染可高达23％，中老年人有慢性心、肺、肾病变、糖尿病、血液病、恶性肿瘤、艾滋病或接受免疫抑制剂者易发本病，且死亡率高达45％，并易合并其他微生物感染，形成难治性肺炎。

近年来，国内感染军团菌的病例时见报道。值得注意的是军团菌病的临床表现是多种多样的，高发于夏秋季节，易侵犯患有慢性器质性疾病或免疫功能低下者，如恶性肿瘤、慢性支气管炎或肺气肿等患者，以及使用激素及免疫抑制剂和器官移植的患者。军团菌在条件致病菌和院内感染中的位置也越来越被人们所重视。

自军团菌病爆发以来，已有许多成熟的方法应用于临床标本军团菌检测鉴定，但传统的军团菌分离培养法难度大、耗时长；血清学检测与其他细菌之间容易存在交叉反应；生化表型鉴定分辨率低，重复性差；其他方法如抗原检测、脂肪酸成分分析等也存在不足。因此，急需一种简单有效的临床标本军团菌检测方法。

实时荧光定量PCR技术是近些年来迅速发展起来的一种核酸检测技术。实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。因为实时荧光定量PCR技术的检测物为致病病原体基因核酸，所以能够准确检测处于疾病各个时期的病原体。目前实时荧光定量PCR所使用的荧光化学可以分为两种：荧光探针和荧光染料。由于Taqman探针具有特异性强、准确性高、对引物及试剂要求不高等优点，使该类型的荧光探针常用于实时荧光定量PCR。为了实现将实时荧光定量PCR技术应用于嗜肺军团菌的检测，很有必要提供一种特异性高、准确性高的嗜肺军团菌核酸检测的引物和探针。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供嗜肺军团菌荧光定量引物及探针、检测方法及试剂盒。本发明提供的引物及探针针对嗜肺军团菌的巨噬细胞感染增强因子(mip)部分基因设计，具有良好的灵敏度、特异性、准确性和精密性。

本发明提供了嗜肺军团菌荧光定量检测引物组，包括如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物和如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物。

本发明还提供了嗜肺军团菌荧光定量检测探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明提供的嗜肺军团菌荧光定量检测探针的3’端标记有MGB淬灭基团；5’端标记有6-FAM发光基团。

本发明根据嗜肺军团菌的保守序列设计合成对应嗜肺军团菌荧光定量引物，本发明提供的探针和引物用于嗜肺军团菌的荧光定量检测具有良好的特异性、重复性和灵敏性。其能检测出的最低拷贝数为100copies/μL。对肺炎支原体、肺炎衣原体和结核分枝杆菌均无交叉反应，具有很高的特异性。以阳性参考品为模板，重复10次反应，Ct值方差小于10％，对嗜肺军团菌待检序列具有很高的准确性。本发明提供的引物和探针对高、低两个浓度的参考品均具有很高的精密性，每批试剂批内变异系数小于5％，连续三批试剂批间变异系数小于5％。