[发明专利]肺炎支原体荧光定量引物及探针、检测方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及肺炎支原体荧光定量引物及探针、检测方法及试剂盒。

背景技术

肺炎支原体(Mycopasma Pneumoniae，MP)是介于病毒和细菌之间的一种微生物，含DNA和RNA，没有细胞壁。MP的全基因测序已经完成，P1蛋白的附近，有两个特异性重复序列(RepPM 2/3和RepMp 4)，可将MP分为两型，一型是以M129为代表的Group 1，二型是以FH为代表的Group 2。编码P1的P1基因位于M129型的180858-185741nt位，共4884个核苷酸，编码1627个氨基酸，G+C含量为54％，远高于全基因序列的平均值40.1％。P1蛋白前体中的前59位氨基酸是一段前导肽，成熟的P1蛋白由1568个氨基酸组成。

肺炎支原体是引起社区获得性肺炎的重要致病原。感染流行周期为4～7年，流行时发病增加3～5倍，可在任何年龄发生，但其下呼吸道感染主要发生在学龄儿童和年轻人，尤其以5～20岁更多见。肺炎支原体通过飞沫以气溶胶微粒的形式传播，传染性较小，需要长时间密切接触才能发病，在家庭成员中易相互传染，其潜伏期16～32d，潜伏期即具传染性，症状出现1周内呼吸道含菌量最高，至症状缓解数周仍具传染性，患者痊愈后可在咽部存留1～5月。

支原体肺炎是一种非常严重的传染性疾病，在肺炎中，支原体肺炎约15％～20％，并且导致多种并发症，支原体肺炎是由肺炎支原体引起的急性肺部感染。肺炎支原体广泛存在，无地区性差异，平时散发，支原体肺炎每4～5年又一次流行。发病季节不明显，寒冷季节发病率较高，占住院肺炎的10％～20％，流行期间可占30％。肺炎支原体的感染可发生在不同年龄的小儿，在年长儿多见，在新生儿中报道不多。肺炎支原体的感染率有逐年增多的趋势，临床主要表现为咳嗽、咳痰、哮喘、气促、胸闷、胸痛及不同程度的发热和惊厥等。

肺炎支原体感染也可导致一系列呼吸系统外疾病，可引起支原体血症，直接侵犯个系统、组织引起病变。国外报道，从肺炎支原体呼吸道感染的病例血液中直接分离出肺炎支原体，提示肺炎支原体可进入血液，存在呼吸道以外的部位增殖的可能性。支原体感染引起的肺外并发症常累及心血管系统、血液系统、中枢神经系统、皮肤及肝肾器官。

由于培养法的困难和血清学方法的滞后，需寻找更灵敏更快速的方法。近十年来，定量PCR检测方法的建立提供了一种快速，可靠的呼吸道病原检测方法。具有快速，灵敏，定量准确等特点。目前，已经有运用多重定量PCR方法同时检测上述病原体的报道，多重定量PCR的应用极大的提高检测的效率，并且节省了样本量。

PCR检测MP的靶基因主要有16S rRNA、ATPase、P1cytadhesin、CARDS toxin、RepMP等，其中P1基因是广泛用于试剂盒的靶基因。

实时荧光定量PCR技术是近些年来迅速发展起来的一种核酸检测技术。实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。因为实时荧光定量PCR技术的检测物为致病病原体基因核酸，所以能够准确检测处于疾病各个时期的病原体。目前实时荧光定量PCR所使用的荧光化学可以分为两种：荧光探针和荧光染料。由于Taqman探针具有特异性强、准确性高、对引物及试剂要求不高等优点，使该类型的荧光探针常用于实时荧光定量PCR。为了实现将实时荧光定量PCR技术应用于肺炎支原体的检测，很有必要提供一种特异性高、准确性高的肺炎支原体核酸检测的引物和探针。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供肺炎支原体荧光定量引物及探针、检测方法及试剂盒，本发明提供的引物及探针针对肺炎支原体P1蛋白基因设计，具有良好的灵敏度、特异性、准确性和精密性。

肺炎支原体荧光定量检测引物组，包括如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物和如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物。

本发明还提供了肺炎支原体荧光定量检测探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明提供的肺炎支原体荧光定量检测探针的3’端标记有MGB淬灭基团；5’端标记有6-FAM发光基团。