[发明专利]一种酶法检测羧酸酯酶2的试剂盒及其使用方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种酶法检测羧酸酯酶2的试剂盒及其使用方法与应用。

背景技术

羧酸酯酶(Carboxylesterases，CE)是丝氨酸水解酶家族的重要成员之一，广泛分布于多种哺乳动物细胞内。该酶参与多种酯类药物、环境毒物及致癌物的解毒和代谢，能有效催化羧酸酯类、氨甲酸酯类、酰胺类、硫酯类等外源性物质的水解。在人体中，羧酸酯酶主要包括羧酸酯酶1(CE1)和羧酸酯酶2(CE2)两个亚型，二者具有40％-60％的氨基酸同源性，而在组织分布和底物特异性上存在显著差异。CE2在人肠道和很多肿瘤组织中高表达，在提高很多前药的口服生物利用度中起着十分重要作用，并且其活性也会影响很多酯类抗癌试剂(如伊立替康和卡培他汀)的疗效。机体羧酸酯酶的组织分布与功能差异不仅决定其处置酯类外源物的能力，还与多种癌症的发生发展密切相关。因此，精确测量不同生物体系中CE2的真实活性在临床上意义十分重大。

截至目前，CE2的定量方法有酶联免疫吸附测定法(ELISA)、免疫印迹法(Western Blotting)、质谱法和荧光检测法等。荧光法由于快速、灵敏精度高等优点而广受欢迎，但是市面上已有的荧光检测方法所使用的底物都存在发射波长短(λ_em＜650nm)的缺点，受生物基质自身荧光的干扰较大。而近红外荧光探针发射波长处于近红外(λ_em＞650nm)，可排除背景荧光干扰，灵敏度高，因而开发基于近红外荧光探针的羧酸酯酶2的荧光检测方法具有很大的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速简便的酶法检测羧酸酯酶2的试剂盒及其使用方法与应用，本发明提供了一种CE2活性检测的试剂盒及其使用方法与应用。该试剂盒使用1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮的苯甲酰酯(DDAB)作为CE2的探针底物，经CE2水解后可生成具有良好光学属性的水解产物。基于单位时间产物的生成量来表示酶的活性。该酶促反应具有选择性高、代谢产物易检测、酶活及抑制活性评价快速高效等特点。

一种检测羧酸酯酶2的试剂盒，该试剂盒包括四种试剂，分别为试剂I、试剂II、试剂III和质控标准品；

所述试剂I为：pH＝7.4,100mM磷酸盐缓冲液，

所述试剂II为0.1～10mM的探针底物1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮的苯甲酰酯(DDAB)溶液，溶剂为甲醇、乙腈、二甲基亚砜中任意一种，

所述试剂III为反应终止剂，可选色谱纯乙腈或色谱纯甲醇，

所述质控标准品为5mg/ml的CE2水溶液。

一种酶法检测羧酸酯酶2的试剂盒的使用方法，具体按下面步骤进行：

(1)预孵育：在总体积为V₀的反应体系中，将待测样品与试剂I混匀，20～60℃下孵育3～5分钟,待测样品终浓度为0-10μg/mL；

(2)起始反应：加入试剂II混匀，试剂II的终浓度5μM，20～60℃下孵育5-20分钟；

(3)终止反应：加入体积数为V₀的试剂III，剧烈震荡10秒；

(4)检测：离心后取上清于酶标仪或全自动生化仪检测荧光值，检测条件为：激发波长600nm，发射波长662nm；或测646nm处的吸光值。

(5)回算：取荧光值代入到标准曲线后计算样品中羧酸酯酶2含量。

所述待测样品为：重组表达人源或动物的羧酸酯酶2单酶、含有羧酸酯酶2的细胞或组织制备液、动物活组织切片、含有羧酸酯酶2的各类细胞等生物体系；

一种酶法检测羧酸酯酶2的试剂盒的应用，该试剂盒用于羧酸酯酶2活性的快速定量检测，以及该酶抑制剂的快速筛选与评估。

所述试剂盒用于羧酸酯酶2活性的快速定量检测的方法为：探针底物DDAB可被羧酸酯酶特异性水解为与发射波长处于近红外的荧光产物DDAO；按照试剂盒的使用方法，通过定量检测单位时间内底物的消除量以及水解产物的生成量来测定不同样本中羧酸酯酶2的活性。

该试剂盒用于羧酸酯酶2抑制剂的快速筛选与评估方法为：以探针底物DDAB水解反应作为CE2的特异性探针反应，按照试剂盒的使用方法，通过定量比较抑制剂存在与缺失状态下单位时间内水解产物的生成量评估该生物体系中CE2的残余活性，进而实现CE2抑制剂的快速筛选及抑制能力的定量评价。