[发明专利]Sip基因重组载体、壳聚糖‑PLGA包裹Sip基因DNA疫苗及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种罗非鱼无乳链球菌Sip基因真核表达重组载体，其特征在于，所述重组载体包括有如SEQ ID No:3所示的碱基序列。

2.权利要求1所述的罗非鱼无乳链球菌Sip基因真核表达重组载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、将Sip基因与pMD^TMl8-T载体连接，转化感受态细胞，得到重组子；

(2)、采用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切步骤(1)的重组子，得到包括有如SEQ ID No:3所示碱基序列的基因片段，再采用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切质粒pcDNA3.1(+)，连接所述基因片段和酶切后的质粒pcDNA3.1(+)，转化感受态细胞，得到罗非鱼无乳链球菌Sip基因真核表达重组载体。

3.根据权利要求2所述的罗非鱼无乳链球菌Sip基因真核表达重组载体的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述Sip基因是以罗非鱼无乳链球菌分离强毒株基因组DNA为模板，SEQ ID No:1和SEQ ID No:2为引物进行PCR扩增得到的。

4.一种壳聚糖-PLGA包裹Sip基因DNA疫苗，其特征在于，所述疫苗的活性成分包括权利要求1所述的罗非鱼无乳链球菌Sip基因真核表达重组载体。

5.根据权利要求4所述的壳聚糖-PLGA包裹Sip基因DNA疫苗，其特征在于，所述疫苗还包括壳聚糖-PLGA包裹微球，所述壳聚糖-PLGA包裹微球是以1～4mg/mL的PLGA、0.3～0.9mg/mL的壳聚糖和0.5～2mg/mL PVA为原料制备而得。

6.根据权利要求5所述的壳聚糖-PLGA包裹Sip基因DNA疫苗，其特征在于，所述壳聚糖-PLGA包裹微球是以2mg/mL的PLGA、0.3mg/mL的壳聚糖和2mg/mL PVA为原料制备而得。

7.根据权利要求4所述的壳聚糖-PLGA包裹Sip基因DNA疫苗，其特征在于，所述罗非鱼无乳链球菌Sip基因真核表达重组载体体积为600μL,浓度0.5～1.5mg/mL。

8.根据权利要求7所述的壳聚糖-PLGA包裹Sip基因DNA疫苗，其特征在于，所述罗非鱼无乳链球菌Sip基因真核表达重组载体体积为600μL,浓度1mg/mL。

9.权利要求4-8任一项所述的壳聚糖-PLGA包裹Sip基因DNA疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、将600μL浓度0.5～1.5mg/mL的权利要求1所述的罗非鱼无乳链球菌Sip基因真核表达重组载体滴入以二氯甲烷为溶剂的浓度为10mL浓度为1～4mg/mL的PLGA溶液中，充分搅拌混匀，制备成初乳；

(2)、将步骤(1)的初乳滴入150mL含有浓度为0.3～0.9mg/mL的壳聚糖的PVA水溶液中，彻底搅拌，形成水包油包水复乳液；所述PVA的浓度为0.5～2mg/mL；

(3)、磁力搅拌上述水包油包水复乳液，使得二氯甲烷挥发完全，离心，获得壳聚糖-PLGA包裹Sip基因DNA疫苗。

10.权利要求1所述的罗非鱼无乳链球菌Sip基因真核表达重组载体，或权利要求4-8任一项所述的壳聚糖-PLGA包裹Sip基因DNA疫苗在制备防治罗非鱼无乳链球菌病的药物中的应用。