[发明专利]用于貉源性成分数字PCR精准定量检测的引物探针及方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体而言，本发明涉及用于貉源性成分定量检测的寡核苷酸引物和探针，用于测定貉源性成分的数字PCR检测方法，用于精准定量貉源性成分的数字PCR检测试剂盒以及貉源性成分的特异性寡核苷酸引物和探针在检测样品中貉源性成分中的应用。

背景技术

肉及其制品营养丰富，蛋白质含量约为10%-20%，畜肉中含丰富的B族维生素，禽肉中不饱和脂肪酸含量较高，如人体必需的亚油酸，约占总脂肪含量的20%。全国范围内肉制品的产量和消费量持续升高，2013年我国成为全球肉类生产第一大国，年产量达8536万吨，伴随而来的是近年来肉制品的掺假掺杂事件频繁发生。2013年，我国部分地区开展了肉及其制品的掺假情况调查，结果显示有25.6%的样品与标识不符，肉制品掺假情况较明显，熟制牛肉和食用羊肉卷是肉类掺假高危品。而貉肉本身也是一种肉质鲜美高级滋补营养野味食品，细嫩鲜美、营养丰富、滋补身体，还可入药，其胆、睾丸是名贵中药材。有些不法商家将其他肉代替貉肉进行销售，或者将貉肉掺入其他肉中冒充牛羊肉。以上肉制品掺假事件严重干扰了我国的肉业生产，不仅成为制约肉品质量提升的主要因素，而且严重损害了消费者的经济利益和知情权，甚至涉及宗教信仰等问题。

然而，目前基于肉类的检测方法基本上都是定性和半定量检测，国家相关标准也只能进行成分的定性检测，无法进行精准定量检测。虽然目前质监、食药监等部门下属的很多实验室均具备一定的肉类DNA鉴定技术，但只能确定“掺假肉”中掺了哪些肉类，而不能判断其掺杂肉的含量。因此很难判断掺杂肉是故意添加还是无意污染，导致难以判定违法厂商的责任，使不少不法商贩得以逃脱惩罚。

目前，肉类定性或半定量检测常采用实时荧光PCR技术，这种技术可以通过Ct值与模板量建立标准曲线，并以此初步确定模板中目标基因的拷贝数。但是，利用实时荧光PCR技术对肉类成分定量检测存在以下问题：（1）每次进行检测操作都需要同时进行已知浓度标准品的扩增并制作标准曲线，提高了检测成本且工作量过大；（2）标准品与实际样品PCR扩增效率的差别可能会引起定量结果产生偏差；（3）通过标准曲线得到了模板拷贝数的准确度存在一定误差。因此，本领域需要一种快速、特异性好、灵敏度高、准确度高的貉源性成分的检测方法和定量方法，进行食品中貉源性成分的检测。

数字PCR(digital polymerase chain reaction, dPCR)是在荧光PCR基础上发展起来的基因绝对拷贝数定量技术，它可以实现单分子DNA的绝对定量，并且它具有测量独立性，无需任何校准物，解决了实时荧光PCR需要Ct值和标准曲线确定拷贝数而产生的结果不准确等问题。目前，该技术已初步应用于肉类产品的定量检测。随着我国对肉类掺假检验能力需求的日益强烈，dPCR 技术的出现为肉类成分定量检测开辟了新的途径，使得食品中肉类成分的定量分析与溯源成为可能。利用dPCR技术提升定量检测方法的准确性与实用价值将成为肉类食品精准定量检测技术发展的一个重要方向。

因此，本领域需要一种快速、特异性好、灵敏度高的貉源性成分的检测方法，能够定量检测貉肉、肉肠、肉卷、肉罐头等样品中貉源性成分含量。

发明内容

本发明的一个目的在于，提供精准定量貉源性成分的特异性寡核苷酸引物和荧光标记探针。

本发明的另一个目的在于，提供精准定量貉源性成分的数字PCR检测方法。

本发明的另一个目的在于，提供精准定量貉源性成分的数字PCR定量检测试剂盒。

本发明的还一个目的在于，提供貉源性成分的特异性寡核苷酸引物和探针在精准定量检测貉源性成分中的应用。

针对上述发明目的，本发明提供以下技术方案：