[发明专利]骨肉瘤循环肿瘤细胞鉴定试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种骨肉瘤循环肿瘤细胞鉴定试剂盒。

背景技术

骨肉瘤(osteosarcoma)也叫成骨肉瘤，是较常见的发生在20岁以下的青少年或儿童的一种恶性骨肿瘤，约占青少年原发性恶性骨肿瘤的60％。骨肉瘤是由间质细胞系发展而来，其恶性程度高，生长速度快，伴随着高频率的远处转移，肿瘤的迅速生长是由于肿瘤经软骨阶段直接或间接形成肿瘤骨样组织和骨组织。目前骨肉瘤仍是儿童和青少年恶性肿瘤死亡率很高的疾病，其恶性程度甚高，预后极差，可于数月内出现肺部转移，截肢后3～5年存活率仅为5～20％，但早期发现和及时治疗可在很大程度上提高该病的生存率。

循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)是因自发或诊疗操作从实体肿瘤病灶(原发灶、转移灶)脱落，进入外周血中的各类肿瘤细胞的统称，目前认为CTCs可能是肿瘤转移的早期阶段。肿瘤细胞在进入外周血循环的过程中可能发生上皮-间质转变(ETM，Epithelial-mesenchymal Transition)，EMT过程中，除了细胞形态和移动性发生改变外，细胞基因表达谱特别是上皮、间质分子标志物及其转录因子的表达也发生改变，发生EMT的肿瘤细胞间黏附改变，迁移和侵袭能力增强。根据CTCs抗原标志物的差异，目前CTCs主要可分为上皮标志物阳性表型(简称上皮细胞型)、间质标志物阳性表型(简称间质细胞型)和上皮与间质混合表型(简称上皮-间质细胞型)等，不同类型CTCs具有不同的迁移和侵袭能力。因此，对骨肉瘤患者循环肿瘤细胞进行鉴定和分型对骨肉瘤的早期诊断、治疗指导以及预后等具有重要意义。

目前对癌症患者CTCs的鉴定和分型主要依赖于皮细胞标志物和间质细胞标志物的检测，常用的上皮细胞标志物主要包括上皮细胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)、角蛋白(keratin,KRT)和E-钙黏蛋白(E-cadherin)等，间质细胞标志物主要包括N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、纤连蛋白(fibronectin)以及EMT相关转录因子AKT2、ZEB1、ZEB2和SNAIL等。根据上皮细胞标志物和间质细胞标志物的表达情况对患者CTCs进行分型，从分型结果可直接评估CTCs的转移能力。但与其他癌症类型不同，骨肉瘤是由间质细胞系发展而来的恶性肿瘤，本身就表达某些间质细胞标志物。因此，不能使用与其他癌症类型相同的间质细胞标志物对骨肉瘤患者CTCs进行分型和转移能力评估。目前，国内外均没有稳定的适应于骨肉瘤患者CTCs分型和转移能力评估的产品。因此，急需筛选出能对骨肉瘤患者CTCs转移能力进行特异性评估的骨肉瘤转移相关间质细胞标志物，并提供一种实现骨肉瘤患者CTCs的精确鉴定、分型和转移能力评估的检测方法。

我们前期提出的申请号为201510919145.6的专利申请，由于技术方案中筛选得到的标志物相对较少，在一定程度上影响了检测的灵敏度和特异性。需要对技术改进，提高其检测的灵敏度和特异性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性强、灵敏度高、准确度高的骨肉瘤循环肿瘤细胞鉴定试剂盒。

实现上述目的的技术方案如下。

一种骨肉瘤循环肿瘤细胞鉴定试剂盒，包括针对每种标志基因mRNA的捕获探针和信号放大系统，所述标志基因mRNA包括有如下两类：选自EpCAM、CDH1、KRT8、KRT16、KRT17、KRT18、KRT19、KRT20中的至少两种的上皮细胞标志基因，选自MMP2、MMP9、VIM、CDH2、FN1、HIF-1a、SERPINE1、SURVIVIN、TWIST1、AKT2、SNAIL中的至少两种的骨肉瘤转移相关间质细胞标志基因；所述信号放大系统包括有末端修饰有荧光基团的扩增探针，或包括有扩增探针和末端修饰有荧光基团的标记探针，不同种类目标基因的荧光基团互不相同；其中，