[发明专利]一种恩诺沙星适配体/分子印迹杂化型上转换荧光探针的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及高分子材料技术领域，尤其涉及一种恩诺沙星适配体/分子印迹杂化型上转换荧光探针的制备方法。

背景技术

恩诺沙星，是氟喹诺酮类抑菌剂中应用最为广泛的品种之一，常被用于兽医临床和水产养殖业中。但因其耐药性和潜在的致癌性引起了广泛的关注。目前恩诺沙星的检测方法主要是仪器法和酶联免疫法，然而仪器法所需仪器昂贵，操作复杂，酶联免疫法需要抗体，抗体稳定性差，制备周期长。这两种方法都存在一定的问题。

适配体(Aptamer)是通过SELEX技术筛选得到的一段可以特异性识别并结合靶分子的寡聚核苷酸片段(DNA或RNA)。适配体能够与靶标分子发生特异性结合，且亲和力高、特异性强。与抗体相比，适配体筛选无需动物实验，可根据需要进行全化学合成；筛选周期短，有效避免抗体存在批次差异大的问题，可实现批量生产；适配体末端易于修饰上各种活性基团，可根据不同分析目的对其进行固定修饰。这些优点使其在分析检测和传感领域中显示出良好的应用前景。

分子印迹技术是模拟天然分子识别现象，人工合成对特定印迹分子具有高度选择性固态高分子聚合物的新技术。因其具有选择性高、稳定性好、制备过程简单、可重复使用等优点，常常被誉为“仿生抗体”，表现出巨大应用潜力。

荧光检测是一种常用的快速检测方法。作为新型发光材料的上转换纳米粒子(UCNPs)发展迅速。UCNPs具有独特的发光性质，以近红外光作为激发光源，可有效避免样品基质自发荧光的干扰，荧光背景信号干扰小。该材料还具有化学稳定性好、荧光寿命长、吸收和发射带窄、量子产率高以及毒性低等诸多优点，是理想的荧光探针标记物。

本发明以上转换荧光纳米粒子标记，将分子印迹聚合物与适配体的高特异性结合，制备一种可应用于恩诺沙星识别与测定的适配体/分子印迹杂化型上转换荧光探针。

发明内容

本发明要解决的问题是提出一种对恩诺沙星同时具有富集和上转换光信号传感复合材料的适配体/分子印迹杂化型上转换荧光探针的制备方法。

本发明的技术解决方案：

一种恩诺沙星适配体/分子印迹杂化型上转换荧光探针的制备方法，采用上转换荧光纳米材料作为载体偶联恩诺沙星适配体，以甲基丙烯酸为功能单体，利用分子印迹技术中的包埋法制备，其制备步骤如下：

一种恩诺沙星适配体/分子印迹杂化型上转换荧光探针的制备方法，制备步骤如下：

(1)将Y₂O₃、Yb₂O₃和Tm₂O₃硝酸化后，加入EDTA、CTAB的乙二醇溶液、HF和浓硝酸，进行水热反应，制得上转换发光材料NaYF₄:Yb,Tm；

(2)将步骤(1)制备的上转换发光材料0.05g-0.2g分散于60mL-100mL异丙醇中；依次加入20mL-40mL的蒸馏水和2.5mL-5mL质量浓度为25％的氨水，室温下搅拌15min-30min；滴加40μL-80μL的正硅酸乙酯(TEOS)，搅拌3h后；滴加200μL-400μL的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，室温下反应1h-2h后停止搅拌，室温下陈化2h-6h；离心分离，得到的固体物质经蒸馏水洗涤三次，60℃-90℃烘干，得到硅烷化上转换发光材料；

(3)将步骤(2)制得的硅烷化上转换发光材料10mg-50mg，分散于5mL-8mL浓度为10mmol/L磷酸缓冲盐溶液(PBS)中，加入1.25mL质量浓度为25％戊二醛溶液，在室温下振荡1h-2h，离心分离，得到的固体物质用10mmol/L的PBS洗三次，重新分散于5mL-8mL浓度为10mmol/L磷酸缓冲盐溶液(PBS)中，加入1mL浓度为0.1mg/mL-0.2mg/mL的亲和素溶液中，在37℃振荡17h-30h，离心分离，得到的固体物质用10mmol/L的PBS洗三次，得到亲和素修饰的上转换发光材料；

(4)将步骤(3)制备的亲和素修饰的上转换发光材料10mg-50mg均匀分散于10mmol/L的PBS中，加入200μL-300μL浓度为1μmol/L的恩诺沙星适配体溶液，在37℃振荡17h-30h，离心分离，得到的固体物质用10mmol/L的PBS洗三次，得到恩诺沙星适配体修饰的上转换发光材料；