[发明专利]基于分子印记纳米磁珠与质谱联用用于大鼠粪便中三七总皂苷代谢物质群的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种三七总皂苷代谢物质群的分析方法，具体涉及一种基于分子印记纳米磁珠分散固相萃取与Orbitrap-MS技术联用用于大鼠粪便中三七总皂苷代谢物质群的检测方法。

背景技术

中药药效物质基础是指中药发挥预防、治疗、诊断疾病作用的化学成分的集合。由于中药成分多样性、作用整体性、作用靶点复杂性，阐明其药效物质基础已成为中药研究的关键和核心问题，已列入国家中长期科学和技术发展规划纲要(2006-2020)、“重大新药创制”科技重大专项以及中医药创新发展规划纲要(2006-2020)相关领域和主题的重要内容。因此建立基于整体观、符合中医药特点和具有广泛适用性的中药复杂药效物质研究关键技术具有重要意义。

三七为五加科植物三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根和根茎。为我国名贵中药材，国际著名的“云南白药”和“片仔癀”中主要原料均为三七，其具有止血、造血、抗血栓、抗心肌缺血、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、抗氧化、抗糖尿病、抗癌、抗衰老、免疫调节活性、等药理作用^[15-20]。三七中富含以人参皂苷R_g1和三七皂苷R₁为代表的原人参三醇(protopanaxatriol,PPT group)类和以人参皂苷Rb1为代表的原人参二醇(protopanaxadiol,PPD group)类成分。中国药典2010版采用高效液相色谱法对上述三种指标成分进行质量控制。但皂苷类成分复杂，紫外吸收响应极低，一直是三七质量评价和药效物质研究的难点。针对其分析难点，目前已有研究采用HPLC–ELSD、MEKC、HSCCC、LC–MSⁿ、UPLC–ESI-MS以及UPLC–Q/TOF技术对其皂苷类成分进行鉴定。体内代谢研究表明，PPT和PPD结构类型的皂苷类成分主要以氧化反应和去糖基化的水解反应为主，其代谢产物的药理活性在不断深入研究和报道。但上述两种结构类型的皂苷类成分体内生物利用度低，体内代谢产物难以检测。目前仅能对原型及主要代谢产物进行定性定量分析，一些微量的代谢产物往往检测不到或者丢失，需要一种选择性强专属性好的富集分离模式并建立基于整体观的体内外物质组表征方法。

发明内容

本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一种基于分子印记纳米磁珠与LTQ-Orbitrap-MS技术联用用于大鼠粪便中三七总皂苷代谢物质群的分析方法。本发明通过制备出具有高磁响应性的磁性纳米粒，为MIPs的制备省去离心、过滤等繁杂的操作，使其更加省时、方便。针对中药三七代谢产物的主要活性成分，发明人通过表面分子印记技术和磁性分离技术的交叉研究，制备出对三七皂苷类化合物具有高灵敏度、高选择性印记磁珠，针对中药体内代谢物质结构特点，采用相应的印记磁珠“垂钓”体内代谢物质群，实现中药三七总皂苷提取物给药后的“多靶标富集”，对目标群进行LTQ-Orbitrap-MS的鉴定与分析，这与传统的有效部位给药后分析代谢物质的方法相比，更充分考虑中药整体(包括复杂的基质背景)作用的特点，有望揭示三七“原型成分-代谢物质群-活性”的相关性，为中药代谢物质群的研究建立了一个有效的分析平台。

本发明的目的是通过以下方式实现的：

一种基于分子印记纳米磁珠与LTQ-Orbitrap-MS技术联用用于大鼠粪便中三七总皂苷代谢物质群的分析方法，该方法包括以下步骤：

(1)制备印记磁珠：将Fe₃O₄@SiO₂纳米粒分散于致孔剂中，加入功能单体，交联剂，引发剂，模板分子人参皂苷Rb₁，搅拌，室温聚合20h，再用乙酸和甲醇混合溶液洗去模板分子，真空干燥；乙酸和甲醇混合溶液的体积比为10：90。

(2)样品处理：大鼠给药三七总皂苷水溶液后，分别于4,8,12,16,20,24,36,72小时的时间点取粪便样品，将每份样品取出相同的量制成混合粪便，随后混合粪便样品处理如下：将混合粪便加入样品重3倍的预处理溶剂涡旋、离心后，取上清液，氮气吹干，预处理溶剂复溶，加入印记磁珠进行吸附解析得到解析液；大鼠给药三七总皂苷水溶液的剂量为600mg/kg；

(3)样品分析：利用LTQ-Orbitrap-MS分析仪对解析液进行分析，鉴定三七总皂苷的代谢物质群: