[发明专利]一种唾液降钙素原酶联免疫检测方法

说明书

技术领域

本发明属于免疫检测分析技术领域，尤其涉及一种唾液降钙素原酶联免疫检测方法。

背景技术

降钙素原(PCT)是一种含116个氨基酸的无激素活性糖蛋白，分子量为13KD。其半衰期为25-30h。在生理情况下由甲状腺-C细胞产生，含量极少，在健康人群的血清或脑脊液中几乎不能被检出。据文献介绍, 在细菌、真菌、寄生虫等感染性疾病并有全身和中枢神经系统性炎症反应时，病菌的内毒素可促使甲状腺-C细胞、肝脏巨噬细胞和单核细胞、肺和肠道组织的淋巴细胞以及神经内分泌细胞等甲状腺以外的组织大量产生PCT，而导致其血清和脑脊液中的含量升高或持续性升高，且与感染的程度、进展或消退呈正相关。在病毒感染、慢性非生物性炎症、癌性发热、药热、自身免疫性疾病以及手术创伤患者的PCT水平却不增高或仅有轻度短暂性增高。其敏感度和特异性远高于传统的C-反应蛋白和外周血白细胞计数的检测，因而具有重要的临床诊断和鉴别诊断价值。

目前检测PCT常用的实验室方法有放射免疫学分析法（RIA）、化学发光免疫分析法(CLIA)、胶体金比色法（GICA）和酶联免疫法（ELISA），众多血液样本PCT检测技术与产品已广泛应用于临床，这些产品取得了比较满意的准确率。但采用唾液进行PCT快速检测的产品还鲜有面市。

其实，唾液与广泛应用于临床检测的血液(包括全血、血清与血浆)均是人体体液的一部分，都属于细胞外液，其大多数成分类似，尤其是临床检测中具有重大意义目标物质的出现时机具有一致性，只是含量存在一定差异。因而唾液被认为是人体健康状态的一面镜子，能反映出机体的各种内环境状态，例如癌症、感染、系统性疾病等。Challacombe的研究结果证实唾液中IgG可及时反映体内IgG的存在；Parry通过RIA及ELISA对唾液的特异性抗体水平进行研究表明：唾液中抗体含量虽远低于血清，IgA、IgG与IgM分别大约为血清含量的1/10、1/800、1/400，但已足够用于某些免疫学诊断。另外在临床中，于唾液中寻找诊断标志物是最理想的方法，因为收集唾液存在简单、方便、无创、经济、不会引起患者不安、操作者易于掌握等优点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简便、快捷、准确的唾液降钙素原酶联免疫检测方法，旨在解决酶联免疫分析技术在人唾液降钙素原免疫分析产品的应用方面仍是空白的问题。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种唾液降钙素原酶联免疫检测方法，包含有唾液收集器、唾液、抗降钙素原抗体、酶标试剂和检测器。所述唾液收集器包括收集管、收集棒、收集刮片的一种或组合；所述抗降钙素原抗体为抗降钙素原单克隆抗体和抗降钙素原多克隆抗体的一种或组合；所述酶标试剂为含有所述酶标物质的液相和/或固相材料；所述检测器为酶联免疫检测器。

进一步的，所述的检测方法包括如下步骤：

步骤一，制备降钙素原标准品：

用pH7.4、20mmol/L PBS缓冲液与胎牛血清按体积比3:1比例混合配制成基础缓冲液，用基础缓冲液将降钙素原重组抗原稀释成浓度为10ng/mL、5ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0ng/ml标准品；

步骤二，制备包被有降钙素原抗体的载体：

载体为微孔板，包被载体通过以下方法制备：降钙素原抗体用包被缓冲液稀释，取待包被载体，将经过稀释的降钙素原抗体负载于载体上，包被结束后，吸去包被缓冲液，再加入封闭缓冲液，置于37℃封闭2小时或4℃封闭过夜；弃去封闭液，室温18～25℃干燥3～4小时后加入干燥剂密封包装，得到降钙素原抗体包被载体，所述包被缓冲液为pH7.2～7.4、10mmol/L磷酸盐溶液，降钙素原抗体的稀释浓度为1ug/mL；稀释的降钙素原抗体在载体上的包被量可为每孔100ul；包被的条件可置于37℃包被2小时或4℃包被过夜；封闭缓冲液为pH7.2～7.4、10mmol/L PBST溶液，内含1％BSA及1～10％蔗糖；封闭缓冲液的加入量可为每孔300ul；封闭后包被载体的干燥环境相对湿度小于30％；

步骤三，制备降钙素原抗体酶标记物：

酶标记抗体的制备方法为：采用戊二醛交联法将降钙素原抗体与碱性磷酸酶偶联，用pH7.2、10mmol/L PBS缓冲液充分透析，在透析后的结合物溶液中加入等体积的甘油，-20℃以下保存；标记好的降钙素原抗体酶结合物可用20％胎牛血清稀释液稀释至工作浓度，置于4℃保存至有效期，胎牛血清稀释液为pH7.4、20mmol/L PBST溶液，内含20％胎牛血清、1～10％蔗糖、0.01％食品红；