[发明专利]一种石刁柏全雄育种方法

权利要求书

1.一种石刁柏全雄育种方法，其特征在于：该育种方法的详细步骤如下：

（1）花药选材与预处理

在春季石刁柏雄株母茎抽生开花时，上午8-10点、下午4-5点取材，选择1.5-2.5mm的花蕾，湿纱布包裹带回实验室，4℃低温预处理4-5d；

（2）配制石刁柏花药诱导培养基

石刁柏花药诱导培养基按每升蒸馏水中由以下物质配制而成：

大量元素：KNO₃ 2500～2700mg/L，NH₄NO₃ 1600～1800mg/L，KH₂PO₄ 440～480mg/L，MgSO₄∙7H₂O 350～390mg/L，CaCl₂∙2H₂O 820～860mg/L；

微量元素：MnSO₄∙4H₂O 20～25mg/L，ZnSO₄∙7H₂O 8.0～9.0mg/L，H₃BO₃ 6.0～6.5mg/L，KI 0.8～0.85mg/L，CuSO₄∙5H₂O 0.02～0.03mg/L，CoCl₂∙6H₂O 0.02～0.03mg/L，Na₂MoO₄∙2H₂O 0.2～0.3mg/L；

铁盐：Na₂-EDTA∙2H₂O 35～40mg/L，FeSO₄∙7H₂O 25～30mg/L；

有机成分：肌醇90～110mg/L，维生素B1 0.09～0.11mg/L，维生素B6 0.45～0.55mg/L，维生素C 0.35～0.45mg/L，烟酸0.45～0.55mg/L，甘氨酸1.8～2.2mg/L，谷氨酞胺0.75～0.85mg/L；

激素：NAA 1.4～1.6mg/L，KT 0.75～0.85mg/L；

凝固剂：植物凝胶 6.0～6.5g/L；

活性添加剂：椰乳14～16g/L，甘露醇13～17g/L，水解酪蛋白 0.35～0.45g/L，活性炭0.5～0.6g/L；

碳源：蔗糖27～33g/L，麦芽糖13～17g/L；

将大量元素、微量元素、铁盐、有机成分和激素先分别配制成一定浓度倍数的母液贮备，配制时，分别加入大量元素、微量元素、铁盐、有机成分、活性添加剂，定容，加热至60-80℃，然后加入碳源、凝固剂和激素，搅拌至沸腾后，待培养基完全融解，停止加热，调节pH为5.7-5.9，然后将培养基分装于500ml的三角瓶中，每瓶盛120ml～150ml的培养基，密封后置于温度为121℃、压力为15kPa高压蒸汽条件下灭菌20min，自然冷却凝固；

（3）花药高糖处理后消毒接种

低温预处理后，将石刁柏花蕾用自来水冲洗2-4h后，筛选花药处于单核晚期的花蕾，浸泡于1mol/L的高糖溶液中20min，转移入超净工作台无菌条件下，先用75%酒精消毒30s，再用0.1%升汞+2-3滴吐温-80消毒10min，无菌水冲洗3～4次后，从花蕾中取出花药，接种到步骤（2）的石刁柏花药诱导培养基上；

（4）花药诱导培养

将接种花药后的培养基置于25-27℃、黑暗状态培养5d后，转移到33-35℃高温黑暗环境下热激培养5d，然后置于适温、光暗交替的环境中进行花药诱导培养，15d后开始诱导出石刁柏花药愈伤；其中适温、光暗交替的花药诱导培养环境控制为：温度26-28℃，光照强度为800-1200lx，光周期为24h光照/24h黑暗；

（5）愈伤分化培养

无菌条件下将诱导成功的直径为0.8-2.0cm的胚性愈伤组织转接到分化培养基上，置于26-28℃、光照强度2500-3000lx、光周期光照12h/黑暗12h环境下进行愈伤组织分化培养，17d后开始分化出石刁柏绿芽；所述分化培养基配方为：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.4mg/L+秋水仙素0.05mg/L+DMSO 0.5g/L；

（6）绿芽扩繁增殖生根

从培养基中挑选高度大于2.5cm的绿芽，切下转移入生根培养基，生根培养25天后，绿芽发育出白色粗壮的根；所述生根培养基配方为：1/2MS+IAA 1.0mg/L+IBA 0.5mg/L+NAA 0.2mg/L+KT 0.2mg/L+吡啶醇0.1mg/L+烯效唑0.1mg/L；

（7）炼苗与移栽

待石刁柏幼苗根长至5-6cm后，将三角瓶封口膜打开炼苗，4～8d后将幼苗从三角瓶中取出，清洗掉根部的培养基残留，移栽到灭过菌的营养土中，放入到温室中使幼苗逐渐适应外界环境，把完全适应、生长旺盛的再生植株移栽到大田，适当遮荫，精心管理；

（8）染色体倍性观察，剔除非二倍体植株，辨别超雄株和雌株

采用根尖压片法观察所得石刁柏植株的倍性，剔除非二倍体植株和体细胞杂株，分辨超雄株和雌株并标识；

（9）石刁柏超雄株和雌株的筛选与杂交

将大田栽培的超雄株和雌株进行农艺性状筛选，选择农艺性状优良的石刁柏超雄株和雌株，杂交获得F1代全雄系；

所述石刁柏的品种为美国品种阿波罗和荷兰品种硕丰。

2.根据权利要求1所述的石刁柏全雄育种方法，其特征在于：所述步骤（2）的石刁柏花药诱导培养基的配方为：

按每升蒸馏水中由以下物质配制而成：

大量元素：KNO₃ 2600mg/L，NH₄NO₃ 1700mg/L，KH₂PO₄ 460mg/L，MgSO₄∙7H₂O 370mg/L，CaCl₂∙2H₂O 840mg/L；

微量元素：MnSO₄∙4H₂O 22.5mg/L，ZnSO₄∙7H₂O 8.5mg/L，H₃BO₃ 6.25mg/L，KI 0.825mg/L，CuSO₄∙5H₂O 0.025mg/L，CoCl₂∙6H₂O 0.025mg/L，Na₂MoO4∙2H₂O 0.25mg/L；

铁盐：Na₂-EDTA∙2H₂O 37.5mg/L，FeSO₄∙7H₂O 27.5mg/L；

有机成分：肌醇100mg/L，维生素B1 0.1mg/L，维生素B6 0.5mg/L，维生素C 0.4mg/L，烟酸0.5mg/L，甘氨酸2.0mg/L，谷氨酞胺0.8mg/L；

激素：NAA 1.5mg/L，KT 0.8mg/L；

凝固剂：植物凝胶6.25g/L；

活性添加剂：椰乳15g/L，甘露醇15g/L，水解酪蛋白0.4g/L，活性炭0.55g/L；

碳源：蔗糖30g/L，麦芽糖15g/L。