[发明专利]一种用于鉴别宽额鲈成分的实时荧光PCR引物和探针、试剂盒及检测方法

说明书

本发明提出了一种用于鉴别宽额鲈成分的实时荧光PCR引物和探针、试剂盒及检测方法。所述引物序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；所述探针序列如SEQ ID NO：3所示，其5’端标记报告荧光染料FAM，3’端标记淬灭荧光染料TAMRA。本发明还保护了用于宽额鲈成分鉴别的实时荧光PCR检测方法。该方法具有操作简单、检测时间短、特异性强、灵敏度高、重现性好等优点，适用于加工鱼肉制品中宽额鲈成分的鉴定，能较好地解决宽额鲈制品错误标签和以次充好的问题。

技术领域

本发明涉及食品质量控制领域，尤其涉及一种用于鉴别宽额鲈成分的实时荧光PCR检测引物和探针及方法。

背景技术

宽额鲈（Promicrops lanceolatus）俗称龙胆，隶属鲈形目，鮨科，主要分布于东南亚、澳大利亚海域及我国南海诸岛、海南岛、台湾附近海域。宽额鲈是我国名贵的食用石斑鱼，由于其价格昂贵，市场上一些不法商贩用低价石斑鱼或其他鱼种冒充它们以牟取利益。由于个体巨大，宽额鲈常常被加工成鱼肉片或者鱼块甚至鱼糜制品出售，这些加工制品从外观上已经不能看出用来加工的原料鱼的种类，需要通过形态以外的方法来确认鉴别。

经查阅国内外文献，国内外学者对宽额鲈的研究较少，基本集中在系统发育学研究方面。丁少雄等2006年用16SrDNA部分序列探讨了包括宽额鲈在内的中国近海30种石斑鱼的分子系统进化关系（动物学报，2006,52,504-513）；庄轩等2006年用细胞色素b基因部分片段研究了包括宽额鲈在内的中国近海石斑鱼类的系统进化关系（中国科学C辑 生命科学，2006,36,27-34）。对宽额鲈进行物种DNA鉴别的应用研究更少，尚未见用于鱼肉制品中宽额鲈成分特异性检测的实时荧光PCR方法报道。2012年Chen等（Food Control，2012：108–112）建立了实时荧光PCR检测石斑鱼成分的方法，该方法虽能检测待测样品中是否含有石斑鱼成分，但不能具体鉴定出是哪种石斑鱼。上述研究成果均不能解决加工鱼肉制品用其他鱼种冒充宽额鲈的问题。

随着美国、欧盟和我国关于水产品标识管理相关的政策法规和措施的出台，要求对产品标签信息进行验证，从而对鱼肉制品的错误标签和以次充好进行监管，因此市场和形势都需要准确、快速、特异的鱼类物种鉴别方法。目前急需一种能较好地解决宽额鲈制品的错误标签和以次充好问题的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一组对鱼肉制品中宽额鲈鱼源性成分进行快速鉴别的引物和探针，以及一种鱼肉制品中宽额鲈成分的实时荧光PCR检测方法，该方法对市场上相关产品的食品安全监测和执法都具有重要意义。

为实现上述目的， 本发明提供一种宽额鲈成分检测用的特异性寡核苷酸引物和Taqman探针，所述引物序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；所述Taqman探针序列如SEQID NO：3 所示，探针的5’端标记报告荧光染料，所述报告荧光染料为FAM，探针的3’端标记淬灭荧光染料，所述淬灭荧光染料为TAMRA。引物和探针序列如下：

SEQ ID NO：1：5’- gttggttacgtccttccc - 3’

SEQ ID NO：2：5’- cgggtaagggtagcgttgtct - 3’

SEQ ID NO：3：FAM - 5’- cacagtcattaccaacctcctctc - 3’- TAMARA

本发明的寡核苷酸引物和探针是根据宽额鲈和其他鱼种的细胞色素氧化酶亚基I（COI）基因序列具有差异性的特点而设计的。本发明的发明人通过大量筛选工作确定了本发明的特异性寡核苷酸引物和探针序列，建立了稳定的实时荧光PCR扩增体系和扩增条件，从而能特异、灵敏地从样品中鉴定宽额鲈成分。上述文献中的方法均不能用于加工鱼肉制品中宽额鲈成分的鉴别。