[发明专利]一种基于具有过氧化物酶活性的纳米酶的ELISA检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种基于纳米酶的ELISA检测方法，更具体地是涉及一种基于具有过氧化物酶活性的纳米酶的ELISA检测方法。

背景技术

过氧化物酶是一种在过氧化氢存在下，能够催化电子给体氧化的蛋白酶。目前，过氧化物酶已经被广泛的应用于化学传感、环境检测和疾病诊断，例如，辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体可用于ELISA检测。然而，蛋白酶具有易失活、不易保存和难制备等不足，极大的限制了过氧化物酶的应用范围。

纳米酶是具有类似于蛋白酶催化能力的纳米材料，它们有合成简单、成本低廉和催化活性强的优点，能够很好的弥补蛋白酶的不足。在各种纳米酶中，铂纳米颗粒由于极强的过氧化物酶活性而被广泛的应用于环境监测与疾病诊断。然而铂纳米颗粒催化活性不稳定、容易发生团聚，并且会由于表面修饰抗体而使催化活性下降，限制了具有过氧化物酶活性的纳米酶在分析检测中的应用。

因此，发展简单、快捷、稳定且能够避免由于修饰导致催化活性下降的方法，制备具有强过氧化物酶活性的纳米酶具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种基于纳米酶的ELISA检测方法，该种纳米酶通过银铂染的方法制备，具有过氧化物酶活性，本发明能够解决现有技术中纳米酶催化活性不稳定，容易由于修饰导致催化活性降低的问题。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：

一种基于具有过氧化物酶活性的纳米酶的ELISA检测方法，适用于双抗体夹心法或双抗原夹心法，其中双抗体夹心法的检测步骤包括：

a)根据待测样品中待测抗原的种类选择相应的捕获抗体和检测抗体；

b)在粒径5～30nm的金纳米颗粒上修饰步骤a)所述的检测抗体，得到修饰有检测抗体的金纳米颗粒；该检测抗体还可以为特异性结合蛋白、小分子蛋白或细胞抗体等；

c)进行ELISA检测：包被捕获抗体→加入待测样品使待测抗原与捕获抗体结合→加入步骤b)得到的修饰有检测抗体的金纳米颗粒并使待测抗原与其中的检测抗体结合，形成捕获抗体-待测抗原-检测抗体-金纳米颗粒复合物；

d)对步骤c)得到的捕获抗体-待测抗原-检测抗体-金纳米颗粒复合物进行银铂染：加入Ag⁺溶液和对苯二酚并使其终浓度分别为62.5～250μM和0.04～5mM，利用对苯二酚还原Ag⁺以在复合物中的金纳米颗粒表面包裹银壳层；洗涤；加入PtCl₆^2-溶液和抗坏血酸并使其终浓度分别为0.25～1mM和2～50mM，利用抗坏血酸还原PtCl₆^2-以在包裹了银壳层的金纳米颗粒表面再包裹铂壳层，得到具有过氧化物酶活性的纳米酶Au@AgPt颗粒，形成捕获抗体-待测抗原-检测抗体-Au@AgPt颗粒复合物；

e)在0.1～10M过氧化氢存在条件下，利用步骤d)得到的捕获抗体-待测抗原-检测抗体-Au@AgPt颗粒复合物中具有过氧化物酶活性的纳米酶Au@AgPt颗粒催化过氧化物酶底物得到产物，检测产物的量以得到待测抗原的量。

双抗原夹心法的检测步骤包括：

a’)根据待测样品中待测抗体的种类选择相应的捕获抗原和检测抗原；

b’)在粒径5～30nm的金纳米颗粒上修饰步骤a’)所述的检测抗原，得到修饰有检测抗原的金纳米颗粒；

c’)进行ELISA检测：包被捕获抗原→加入待测样品使待测抗体与捕获抗原结合→加入步骤b’)得到的修饰有检测抗原的金纳米颗粒并使待测抗体与其中的检测抗原结合，形成捕获抗原-待测抗体-检测抗原-金纳米颗粒复合物；

d’)对步骤c’)得到的捕获抗原-待测抗体-检测抗原-金纳米颗粒复合物进行银铂染：加入Ag⁺溶液和对苯二酚并使其终浓度分别为62.5～250μM和0.04～5mM，利用对苯二酚还原Ag⁺以在复合物中的金纳米颗粒表面包裹银壳层；洗涤；加入PtCl₆^2-溶液和抗坏血酸并使其终浓度分别为0.25～1mM和2～50mM，利用抗坏血酸还原PtCl₆^2-以在包裹了银壳层的金纳米颗粒表面再包裹铂壳层，得到具有过氧化物酶活性的纳米酶Au@AgPt颗粒，形成捕获抗原-待测抗体-检测抗原-Au@AgPt颗粒复合物；