[发明专利]改造的转铁蛋白DNA结合域、重组DNA聚合酶及制备方法

说明书

本发明公开了一种改造的转铁蛋白DNA结合域，所述转铁蛋白为乳转铁蛋白LTF、血清铁传递蛋白TF、黑素转铁蛋白MTF或卵转铁蛋白OTF，所述各转铁蛋白的N端具有一段同源的DNA结合域，其中，DNA结合域的第10位、第20位分别为C；所述改造的转铁蛋白DNA结合域的氨基酸序列为：将第10位与第20位的C换为其他氨基酸，使其不能形成二硫键。本发明还公开了重组DNA聚合酶及其制备方法，采用上述改造的转铁蛋白DNA结合域与DNA聚合酶进行偶联，本发明还公开了一种含有上述重组DNA聚合酶的PCR检测试剂盒，本发明获得的重组DNA聚合酶不易受抑制剂抑制，可以实现直接PCR，同时可提高检测的灵敏度和稳定性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及改造的转铁蛋白DNA结合域、重组DNA聚合酶及制备方法。

背景技术

脱氧核糖核酸(DNA)是生命遗传信息保存和传递的载体，细胞内参与脱氧核糖核酸合成的DNA聚合酶(DNA polymerase)是实现DNA分子自体复制和遗传信息传递功能的关键分子。生物技术的发展提供了DNA分子的体外复制方法，并由此发展起来的核酸分子检测技术已日益成为各种生物检测的关键技术，广泛应用于药物开发、食品安全性检测、病原微生物鉴定、疾病机理和药物靶向治疗等理论研究与检验之中。

体外酶法合成DNA分子的关键是得到满足不同需要的耐热DNA聚合酶(thermostable DNA polymerase)。例如：进行PCR扩增的耐热DNA聚合酶、抗酶抑制剂(inhibitors)的耐热DNA聚合酶、能在超低模板浓度下扩增DNA的耐热DNA聚合酶等。

临床体外诊断中经常需要对体液中的核酸进行扩增检测，而在体液中存在多种PCR反应抑制剂，如：氯化血红素、钙离子、血红蛋白、转铁蛋白、免疫球蛋白等。这些PCR抑制剂的存在限制了直接采用体液进行PCR扩增，通常需进行核酸纯化去除PCR反应抑制剂后，采用纯化后的核酸进行PCR扩增。

国外的研究发现，利用古细菌(Archaebacteria)核酸结合蛋白的DNA结合结构域(DNA binding motif)与耐热DNA聚合酶(thermostable DNA polymerase)重组(chimericrecombination)，可构建出对模板DNA亲和力(infinity to DNA template)提高、且保留原DNA聚合酶各种功能的新型耐热DNA聚合酶。这种重组耐热DNA聚合酶具有以下特点：(1)与模板DNA分子的亲和力大大提高，能在模板DNA分子浓度很低的情况下与之结合，开启DNA合成；(2)与模板DNA分子亲和力提高的重组耐热DNA聚合酶，能在更加复杂的反应环境中，例如：含有污染物或干扰分子的DNA初级制品或原始材料溶液中，启动DNA合成；(3)与特异病原物基因组DNA的某些区段具有显著提高的亲和力，能在更低的模板DNA浓度或更加复杂的干扰分子存在时，开启DNA合成。这些特点，可改善核酸分子检测的过程(使之更简化和可规模化操作)和提高检测灵敏度及稳定性。

而目前具有上述优点的重组DNA聚合酶数量较少，因此，急需加强这方面研发工作。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于获得不易受生物大分子(多糖、蛋白质)、有机和无机污染分子(为释放DNA和变性生物大分子加入化合物)等抑制的新型重组DNA聚合酶，实现直接PCR；获得与模板分子亲和力提高的新型重组DNA聚合酶，实现对更低浓度模板的扩增，提高检测的灵敏度和稳定性。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种改造的转铁蛋白DNA结合域，所述转铁蛋白为乳转铁蛋白LTF、血清铁传递蛋白TF、黑素转铁蛋白MTF或卵转铁蛋白OTF，所述各转铁蛋白的N端具有一段同源的DNA结合域，其中，DNA结合域的第10位、第20位分别为C；所述改造的转铁蛋白DNA结合域的氨基酸序列为：将所述DNA结合域中第10位与第20位的C换为其他氨基酸，使其不能形成二硫键。