[发明专利]一种里氏木霉重组t-PA的分离纯化方法

权利要求书

1.一种里氏木霉重组t-PA的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

将里氏木霉发酵制得的含有t-PA的粗酶液预处理后得到澄清液；

所述澄清液采用D296强阴离子交换树脂柱进行脱色，脱色后用磷酸缓冲液洗脱，得到洗脱液；所述D296强阴离子交换树脂柱的直径为1.5±0.2cm，长度为30±1cm；所述澄清液在D296强阴离子交换树脂柱中的线速度小于 0.5cm/min；

所述洗脱液采用硫酸铵进行盐析，盐析时，硫酸铵的添加量为：用硫酸铵调节所述洗脱液至饱和度为40%-50%；盐析后，在2-6℃，以7000-8000r/min 离心20-30min，得到沉淀；

将所述沉淀用磷酸缓冲液溶解，所述沉淀与所述磷酸缓冲液的质量比为1:4-6；然后进行透析脱盐；

脱盐后的酶液采用Q-Sepharose High Performance强离子交换色谱进行分离纯化，用磷酸缓冲液配置成的0-1mol/L的氯化钠进行梯度洗脱收集得到活性组分液；所述Q-Sepharose High Performance强离子交换色谱中的柱子的直径为2.6±0.2cm，长度为7±1cm；流速为1.8-2.2 mL/min；

所述活性组分液经冷冻抽干即得t-PA成品；

所述盐析的温度为2-6℃，时间为7-9h；

所述透析脱盐采用透析袋进行，所述透析袋截留分子量为10000 Da；

上述步骤中使用的磷酸盐缓冲液的浓度均为0.018-0.022 mol/L，pH均为7.3-7.5。

2.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，盐析时，硫酸铵的添加量为：用硫酸铵调节所述洗脱液至饱和度为45%。

3.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，所述透析袋在使用前，先在0.9-1.1mol/L EDTA溶液中煮沸8-15min，再在质量浓度为1.9%-2.1%的NaHCO₃溶液中煮沸8-12min，最后在蒸馏水中煮沸8-15min。