[发明专利]一种体外扩增NK细胞的方法及其获得的NK细胞

说明书

技术领域

本发明涉及一种体外扩增NK细胞的方法，尤其是以外周血单个核细胞(PBMC)作为种子细胞，通过在诱导培养开始及每次扩大培养时，将细胞加入到预先包被CD16Mab的培养瓶中，对细胞进行连续刺激并最终制备大量高纯度NK细胞的方法及其获得的NK细胞。

背景技术

肿瘤是目前困扰人类的最为重大的疾病，无论发病率和死亡均高居第一。肿瘤的免疫疗法作为肿瘤治疗的第四种手段正逐渐被人们所接受，NK细胞作为肿瘤免疫治疗技术中一个非常重要的组成部分，因其细胞毒性强、起效迅速且无抗原抑制性等优点而得到广泛的重视。并且，除了肿瘤细胞杀伤的功能外，NK细胞还具有抗病毒感染这一特有属性。目前，困扰NK细胞大规模应用的最大问题是其体外扩增困难，且制备成本较高。而以肿瘤滋养层促进NK细胞扩增的方法虽然能够获得大量的高纯度的的细胞，但是安全性问题却是其无法绕过的门槛。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种体外扩增NK细胞的方法及其获得的NK细胞，以外周血中分离获得的单个核细胞作为种子细胞，通过以CD16Mab包被培养瓶进行连续刺激的方法最终制备大量高纯度NK细胞的方法以及获得的NK细胞。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种体外扩增NK细胞的方法，包括以下步骤：

1)以外周血中分离获得的单个核细胞PBMC作为种子细胞；

2)配制NK细胞完全培养基：含有体积分数5-8％的FBS，以及终浓度500-1000IU/ml的IL-2、终浓度20-100IU/ml的IL-12、终浓度20-100IU/ml的IL-15的免疫细胞培养基；

3)以NK细胞完全培养基配制CD16Mab包被液：NK细胞完全培养基中含有4-8ug/ml的CD16Mab；

4)在细胞培养瓶中加入1-5mlCD16Mab包被液，包被4-24h；

5)将单个核细胞按照3-8*10⁵/ml的细胞终浓度接种到预包被CD16Mab的细胞培养瓶中，加入NK细胞诱导培养基以及终浓度500-1000IU/ml的IFN-r,诱导扩增NK细胞；

6)每3-4天将每瓶细胞悬液平均分配到2个以CD16Mab包被液预包被4-24h的细胞培养瓶中，并补加1-2倍体积的NK细胞诱导培养基；

7)培养的第19-20天收集所有细胞培养瓶中的全部细胞。

具体地说，包括以下步骤：

1)以Ficoll淋巴细胞分离液从外周血中分离获得单个核细胞；

2)配制NK细胞完全培养基：含有体积分数5-8％的FBS，以及终浓度500-1000IU/ml的IL-2、终浓度20-100IU/ml的IL-12、终浓度20-100IU/ml的IL-15的免疫细胞培养基；

3)CD16Mab包被液的配制：NK细胞完全培养基中含有4-8ug/ml的CD16Mab；

4)将步骤1)获得的细胞按照3-8*10⁵/ml的细胞终浓度接种到提前加入了5mlCD16Mab包被液，在4℃条件下包被了4-24h的T-175细胞培养瓶中，加入NK细胞完全培养基至培养体系为50-100ml,并按照终浓度500-1000IU/ml加入IFN-r，开始诱导培养；

5)诱导培养的第4天，在培养体系中加入等体积的NK细胞完全培养基继续培养；

6)培养的第6天，取2个新的T-175细胞培养瓶，每瓶加入5mlCD16Mab包被液，4℃条件下包被4-24h；

7)培养的第7天，将诱导培养的NK细胞悬液混合均匀后平均加入到2个包被好的T-175细胞培养瓶中，并加入等体积的NK细胞完全培养基继续培养；

8)培养的第9天，取4个新的T-175细胞培养瓶，每瓶加入5mlCD16Mab包被液，4℃条件下包被4-24h；

9)培养的第10天，将诱导培养的NK细胞悬液混合均匀后平均加入到4个包被好的T-175细胞培养瓶中，并加入等体积的NK细胞完全培养基继续培养；

10)培养的第12天，取8个新的T-175细胞培养瓶，每瓶加入5mlCD16Mab包被液，4℃条件下包被4-24h；

11)培养的第13天，将诱导培养的NK细胞悬液混合均匀后平均加入到8个包被好的T-175细胞培养瓶中，并加入等体积的NK细胞完全培养基继续培养；

12)培养的第15天，取16个新的T-175细胞培养瓶，每瓶加入5mlCD16Mab包被液，4℃条件下包被4-24h；