[发明专利]一种高产蛋白酶霉菌菌株的快速筛选方法

权利要求书

1.一种高产蛋白酶霉菌菌株的快速筛选方法，包括以下步骤：

(1)菌种活化：将需要进行筛选的多种或多株霉菌菌株分别接种于霉菌生孢子培养基斜面，然后恒温培养；

(2)制备高蛋白酶霉菌定向筛选平板：在灭菌干燥后的平皿中先倒入下层对照培养基，待其冷却凝固后再倒入上层筛选培养基；所述的下层对照培养基为纯琼脂培养基；所述的上层筛选培养基为改良酪素培养基；所述改良酪素培养基中添加去氧胆酸钠作为霉菌菌丝蔓延抑制剂；

(3)放置并固定筛选装置：在上层筛选培养基待凝过程中放置多个同等大小的无菌小杯，培养基凝固后无菌小杯固定；

(4)待测霉菌孢子悬液制备及活化：无菌生理盐水洗下步骤(1)中培养好的霉菌孢子，无菌擦镜纸过滤除菌丝后接入孢子活化液体培养基活化，再调整孢子浓度；

(5)待测霉菌测定前培养：等量吸取步骤(4)制备的各霉菌活化孢子悬液，分别注入上述步骤(2)制得的高蛋白酶霉菌定向筛选平板的各无菌小杯中，接种完成后置于恒温培养箱中培养；

(6)待测霉菌蛋白酶酶活对比筛选：上述步骤(5)的培养完成后，量取高蛋白酶霉菌定向筛选平板上各无菌小杯周围形成的透明圈直径；根据透明圈直径大小确定各霉菌菌株蛋白酶活力大小，透明圈越大，无菌小杯中接种的霉菌菌株蛋白酶活力越大。

2.根据权利要求1所述的快速筛选方法，其特征在于，所述步骤(1)中，选用的霉菌生孢子培养基主要由100～110g/L玉米粉、150～160g/L马铃薯、20～25g/L蔗糖、15～20g/L琼脂配制而成，pH自然；马铃薯需去皮、切块、煮熟处理，煮熟时间不低于30min，再用纱布过滤，利用滤液配制培养基；121℃灭菌20min。

3.根据权利要求1所述的快速筛选方法，其特征在于，所述改良酪素培养基的具体配方浓度包括：干酪素3～6g/L、去氧胆酸钠1.0～2.0g/L、磷酸二氢钾0.36g/L、硫酸锰0.5g/L、氯化锌0.014g/L、磷酸氢二钠1.07g/L、氯化钠0.16g/L、硫酸亚铁0.002g/L、氯化钙0.002g/L、琼脂粉15～20g/L；pH 6.5～7.0；121℃灭菌20min。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的快速筛选方法，其特征在于，所述步骤(3)中，筛选装置无菌小杯采用牛津杯或直径1cm、高1cm的玻璃小管，无菌小杯在Φ60mm、Φ90mm、Φ120mm、Φ150mm的培养皿中的放置数量分别为3～4个、4～5个、11～12个、18～19个；无菌小杯放置的位置为距离皿底1～2mm处。

5.根据权利要求1～3中任一项所述的快速筛选方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述孢子活化液体培养基主要由浓度10～12g/L发芽大麦、3.0～5.0g/L玉米浆、15～20g/L葡萄糖配制而成，pH自然；121℃灭菌15min。

6.根据权利要求1～3中任一项所述的快速筛选方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述孢子活化条件为：摇床温度为28℃，转速为160r/min；孢子活化时间为5～6h。

7.根据权利要求1～3中任一项所述的快速筛选方法，其特征在于，所述步骤(4)中，将制备得到的霉菌孢子悬液的孢子浓度调整为10⁶个/mL。

8.根据权利要求1～3中任一项所述的快速筛选方法，其特征在于，所述步骤(1)中，恒温箱中培养的温度为28±0.1℃，培养时间为48h；所述步骤(5)中，恒温培养箱中培养的温度为28±0.1℃，培养时间为1～2d。