[发明专利]基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法

说明书

技术领域

本发明涉及检测技术领域，具体的说，涉及了一种基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法。

背景技术

在检测领域中，常常需要对各类抗原或抗体进行定性或定量检测。现有技术中，已经以“双抗夹心”为基础衍生出多种免疫反应分析方法，如：放射免疫法、酶联免疫法、化学发光法、时间分辨荧光法和荧光免疫法等，可用于确定病原微生物，对人体的特异性蛋白定量检测从而对疾病进行辅助诊断或监测等等，用途非常广泛。这类免疫反应分析方法的通常作法是：将捕获抗体固定于固相载体，然后与抗原(目标蛋白)反应，洗涤后再与标记抗体反应，洗涤，加入底物检测光信号或直接检测荧光信号。虽然上述方法的自动化免去了人工洗涤的烦琐，但存在固相载体的分离效率较低、检测精度不高等缺点。

为了解决以上存在的问题，人们一直在寻求一种理想的技术解决方案。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，从而提供一种以纳米固相颗粒为载体，具有分离效率高、检测精度高且具有高度特异性的基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法，具体步骤包括：

提供一种表面被DNMT1单克隆抗体共价修饰的Fe₃O₄纳米免疫磁性颗粒悬浮液，记作为Fe₃O₄@McAb；

提供一种表面被量子点标记的DNMT1多克隆抗体，记作为QDs@PcAb；

将经CB缓冲液稀释后的所述Fe₃O₄@McAb与经PBS缓冲液稀释后的DNMT1标准样或待测目标物进行温育反应50 min～60 min，使得所述DNMT1标准样或待测目标物被Fe₃O₄@McAb捕获、富集分离；

然后将经PBST缓冲液稀释后的所述QDs@PcAb与被Fe₃O₄@McAb捕获、富集分离的所述DNMT1标准样或待测目标物进行温育反应110 min～130 min，使得所述QDs@PcAb与所述DNMT1标准样或待测目标物相结合；经PBST缓冲液稀释后，在多功能微孔板读数仪上测定270 nm激发下反应产物的荧光强度；

根据检测的荧光强度与所述DNMT1标准样或待测目标物浓度之间的关系，分段建立检测DNMT1的回归方程。

需要说明的是，上述各步骤中，CB代表碳酸盐缓冲液、PBS代表磷酸盐缓冲溶液、PBST代表添加Tween-20非离子表面活性剂的磷酸盐缓冲溶液。

基于上述，所述基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法，还包括采用ELISA法检测提供的所述Fe₃O₄@McAb的生物活性的步骤。

基于上述，提供一种所述Fe₃O₄@McAb的步骤包括：

（1）清洗：将Fe₃O₄纳米颗粒悬浮液经超声、磁分离弃上清处理后采用浓度为0.01 mol/L～0.015 mol/L、pH为6.0的MES缓冲液对其平衡2 min～5 min，然后进行磁分离弃上清得到第一沉淀物。其中MES代表吗啉乙磺酸缓冲液；

（2）活化：向所述第一沉淀物中依次加入浓度为8 mg/mL～10 mg/mL EDC溶液和浓度为8 mg/mL～11 mg/mL NHS溶液进行涡旋反应10 min～15 min，磁分离、弃上清处理后采用MES缓冲液对其洗涤3次，然后再进行磁分离、弃上清处理得到第二沉淀物。其中，EDC代表(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液、NHS代表N-羟基琥珀酰亚胺溶液、MES代表吗啉乙磺酸缓冲液、mg/mL代表毫克每毫升；

（3）缓冲体系转换：采用PBS缓冲液对所述第二沉淀物洗涤3～4次次，磁分离得到第三沉淀物；

（4）偶联：向所述第三沉淀物中加入DNMT1单克隆抗体和PBS缓冲液进行涡旋反应1.5h～2h，经磁分离、弃上清处理后采用PBS缓冲液对其清洗2次，磁分离、弃上清得到第四沉淀物；