[发明专利]一株噻虫啉、啶虫脒单克隆抗体杂交瘤细胞株GW及其应用

说明书

一株噻虫啉、啶虫脒单克隆抗体杂交瘤细胞株GW及其应用，属于食品安全免疫学检测领域。本发明噻虫啉、啶虫脒完全抗原与等量QuickAntibody‑Mouse 5W佐剂混合均匀，通过大腿肌肉注射BALB/c小鼠。首次免疫100μg/只，多次加强免疫50μg/只，每次免疫间隔21天，最后一次用噻虫啉、啶虫脒完全抗原（25μg/只，不含佐剂）冲击免疫。取高效价低IC₅₀小鼠的脾细胞，通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，经过间接竞争酶联免疫法筛选和三次亚克隆，得到一株杂交瘤细胞株。此细胞株分泌的单克隆抗体，对噻虫啉、啶虫脒具有较好的特异性和检测灵敏度（IC₅₀值分别为0.1 ng/mL、0.4 ng/mL），可实现对水、果蔬、谷物中噻虫啉、啶虫脒残留量的检测，为食品中噻虫啉、啶虫脒残留的免疫检测提供了条件，具有实际应用价值。

技术领域

本发明涉及一株噻虫啉、啶虫脒单克隆抗体杂交瘤细胞株GW及其应用，属于食品安全免疫学检测领域。

背景技术

噻虫啉、啶虫脒均属烟碱类杀虫剂，是烟碱型乙酰胆碱受体的作用体，目前在农业生产中已广泛使用，噻虫啉属低毒类杀虫剂，啶虫脒属中毒杀虫剂。此两种药主要作用于昆虫神经接合后膜，通过与烟碱乙酰胆碱受体结合，干扰昆虫神经系统正常传导，引起神经通道的阻塞，造成乙酰胆碱的大量积累，从而使昆虫异常兴奋，全身痉挛、麻痹而死。具有较强的触杀、胃毒和内吸作用。多用于水果、蔬菜等防除大多数害虫。有文章报道，烟碱类杀虫剂暴露可能会对哺乳动物神经系统的发育产生影响。在欧盟食品安全局（EFSA）审查发现烟碱类杀虫剂对蜜蜂有害之后，近两年欧盟已限制了烟碱类杀虫剂药在一些作物上的使用。

目前检测噻虫啉、啶虫脒色谱法应用最为广泛，包括气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、气质联用(GC-MS)、液质联用(LC-MS)、超临界流体色谱(SFC)、毛细管电泳(CE)等的仪器方法，但这些方法需要昂贵的仪器、专业的操作人员，且样品前处理复杂，成本高，时间长，不能实现大量样品的快速检测，因此建立快速简便的噻虫啉、啶虫脒检测方法具有重要意义。酶联免疫法（ELISA）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。建立高效的免疫学检测方法，筛选高特异性的单克隆抗体是重要前提。

发明内容

本发明的目的在于提供一种噻虫啉、啶虫脒具有高特异性和检测灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备方法。提供一株抗噻虫啉、啶虫脒单克隆抗体杂交瘤细胞株，由该细胞株制备的抗体对噻虫啉、啶虫脒具有较好特异性和检测灵敏度，可以用来建立噻虫啉、啶虫脒的免疫学检测方法。

本发明的技术方案，一株噻虫啉、啶虫脒单克隆抗体杂交瘤细胞株GW，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.12014。

抗噻虫啉、啶虫脒单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCC No.12014的噻虫啉、啶虫脒单克隆抗体杂交瘤细胞株GW分泌产生。

所述抗噻虫啉、啶虫脒单克隆抗体的应用，用于食品安全检测中噻虫啉、啶虫脒的分析检测。

本发明提供的GW细胞株的制备基本步骤为：

1）半抗原的合成：

将啶虫脒原药1 （2.2g，10 mmol），巯基丙酸（2.12 g，2eq），Cs₂CO₃（32.6g，10eq）混悬于己二酸二甲酯（40mL）中，120℃下反应16 h（过夜），冷至室温，加入四氢呋喃（50 mL）后过滤，所得固体粗品（35g，易吸潮）加入少量水中，prep-HPLC纯化，最后得到70mg半抗原ATPA。用液质联用分析法进行鉴定与分析；