[发明专利]一株吡虫啉单克隆抗体杂交瘤细胞株YH5及其应用

说明书

一株吡虫啉单克隆抗体杂交瘤细胞株YH5及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明吡虫啉完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化完全，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。首次免疫（100μg/只）用完全弗氏佐剂，多次加强免疫（50μg/只）用不完全弗氏佐剂，最后一次用吡虫啉完全抗原（25μg/只，不含佐剂）冲击免疫。取高效价低IC₅₀小鼠的脾细胞，通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，经过间接竞争酶联免疫法筛选和三次亚克隆，得到一株杂交瘤细胞株。此细胞株分泌的单克隆抗体，对吡虫啉具有较好的特异性和检测灵敏度（IC₅₀值为0.3 ng/mL），可实现对水、果蔬、谷物中吡虫啉残留量的检测，为食品中吡虫啉残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。

技术领域

本发明涉及一株吡虫啉单克隆抗体杂交瘤细胞株YH5及其应用，属于食品安全免疫检测领域。

背景技术

吡虫啉是一种新型的硝基亚甲基类的高效内吸性广谱杀虫剂，属新烟碱类药物，是烟碱型乙酰胆碱受体的作用体，目前在农业生产中已广泛使用，属低毒类杀虫剂，对蜜蜂的毒性为高毒。2002年，意大利北部和法国一些地区在使用吡虫啉过程中出现蜜蜂大量消失的现象，新烟碱类药物属于神经毒素，可以阻碍蜜蜂及其他昆虫大脑中的感受器接收神经信号。

2012年木村黑田（Kimura-Kuroda）等人在PLoS One杂志上发表的一篇科学论文，提出吡虫啉的暴露可能会对哺乳动物神经系统的发育产生影响。欧盟食品安全局（EFSA）针对此论文分析发现，吡虫啉可能会对人类发育中的神经系统造成影响。在EFSA审查发现吡虫啉对蜜蜂有害之后，近两年欧盟已限制该药在一些作物上的使用（《Agrow》No.665，p6）。建立针对吡虫啉的快速、准确和灵敏的检测方法很有必要。

目前检测吡虫啉色谱法应用最为广泛，包括气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、气质联用(GC-MS)、液质联用 (LC-MS)、超临界流体色谱(SFC)、毛细管电泳(CE)等的仪器方法，但这些方法需要昂贵的仪器、专业的操作人员，且样品前处理复杂，成本高，时间长，不能实现大量样品的快速检测，因此建立快速简便的吡虫啉检测方法具有重要意义。酶联免疫法（ELISA）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。建立高效的免疫学检测方法，筛选高特异性的单克隆抗体是重要前提。

发明内容

本发明的目的是提供一株吡虫啉单克隆抗体杂交瘤细胞株，由该细胞株制备的抗体对吡虫啉具有较好特异性和检测灵敏度，可以用来建立吡虫啉的免疫学检测方法。

本发明的技术方案，一株吡虫啉单克隆抗体杂交瘤细胞株YH5，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.12015。

吡虫啉单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCC No.12015的吡虫啉单克隆抗体杂交瘤细胞株YH5分泌产生。

所述吡虫啉单克隆抗体的应用，用于食品安全检测中吡虫啉残留的分析检测。

本发明提供的吡虫啉单克隆抗体杂交瘤细胞株YH5的制备基本步骤为：

1）半抗原的合成：

将吡虫啉原药1(2 g，7.82 mmol），巯基丙酸（1.66 g，2 eq），Cs₂CO₃（25.5g，10 eq）混悬于己二酸二甲酯（30 mL）中，120℃下反应16 h，冷至室温，加入四氢呋喃（50 mL）后过滤，所得固体粗品（30g）加入少量水中，prep-HPLC纯化，最后得到100mg半抗原IMPA。用液质联用分析法进行鉴定与分析；