[发明专利]O型FMDV抗体直接竞争ELISA检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种可用于检测O型FMDV抗体的直接竞争ELISA试剂盒，属于生物技术领域。

背景技术

口蹄疫(foot-and-mouth disease，FMD)是一种高度接触性传染病，猪、牛、羊等偶蹄类动物最易感。口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，FMDV)目前共有7个血清型，分别命名为O、A、C、南非I(SAT 1)、南非II(SAT 2)、南非III(SAT 3)和亚洲I(Asia 1)，不同的FMDV血清型之间不产生交叉免疫保护。自2005年到2014年，我国一共向世界动物卫生组织(OIE)报道了115次FMD疫情，其中Asia 1型疫情46次，O型疫情38次，A型疫情31次。2009年以后，我国主要流行O型和A型FMD疫情，其中O型FMDV变异性强，传播广泛，严重危害畜牧养殖业发展。

FMDV是一种多抗原表位、高度变异的病毒。病毒无囊膜结构，衣壳蛋白由VP1、VP2、VP3和VP4四种结构蛋白组成。研究表明，O型FMDV表面至少有5个中和抗原表位，其中3个表位集中在VP1蛋白，由G-H环的133-157和C端的200-213氨基酸残基组成的线性表位是FMDV最重要的抗原位点，也是影响抗原变异的关键位点。VP1蛋白可诱导动物产生中和抗体，是FMD的免疫预防、遗传演化的重要研究对象。

我国目前采取免疫与扑杀相结合的FMD防控策略，血清学抗体监测是影响疫情防控的关键所在。FMD的血清学诊断广泛应用于进出口贸易监测、疑似病例确诊、疫病净化以及疫苗免疫效果监测。其中OIE推荐的血清学诊断技术有3种，包括病毒中和试验(VN)、固相阻断ELISA和液相阻断ELISA。VN试验是最经典的血清学诊断方法，但是该方法需要使用细胞进行病毒培养，试验周期长。与VN试验相比，液相阻断ELISA和固相阻断ELISA均缩短了试验时间，但是仍然需要多次的抗体孵育和洗涤，检测速度受限制。随着免疫学和生物技术的发展，建立敏感、特异、快速的血清学检测方法对FMD的防控具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测O型FMDV抗体的直接竞争ELISA试剂盒。该试剂盒可克服现有血清学诊断技术的不足，具备敏感、特异、快速、廉价、制备简单等特点。

本发明试剂盒的检测原理：辣根过氧化物酶(HRP)标记的特异性兔源抗体与待测血清样品中的FMDV抗体竞争结合酶标板微孔中包被的O型FMDV基因工程抗原。加入显色液，通过HRP催化显色反应，显色深浅与待测样品中的抗体含量呈反相关。

根据本发明的O型FMDV抗体直接竞争ELISA检测试剂盒中含有酶标板、洗涤液、样品稀释液、HRP标记兔抗、底物A液、底物B液、终止液、阳性对照血清、阴性对照血清以及封板膜，其中所述酶标板包被有O型FMDV基因工程抗原。该抗原蛋白含有O型FMDV主要的中和抗原表位，对疫苗免疫或病毒感染产生的保护性中和抗体具有很强的亲和力，这就决定了试剂盒的特异性和敏感性。

所述O型FMDV基因工程蛋白的制备方法，包括以下步骤：从NCBI基因库中调取O型FMDV衣壳蛋白基因序列，对序列进行密码子优化。合成基因，构建重组表达菌株pET-32a/BL21。将菌株进行大量诱导表达，使用亲和层析和离子交换技术纯化蛋白。

所述HRP标记兔抗是由O型FMDV基因工程蛋白免疫兔子获得，其制备方法如下：以基因工程技术表达的O型FMDV衣壳蛋白为免疫原，免疫兔子获得血清，血清经饱和硫酸铵和G柱纯化后与HRP进行偶联。HRP标记兔抗与包被抗原具有很高的结合活性，同时与样品血清中O型FMDV抗体具有很强的竞争活性。此外HRP标记兔抗可以分解底物，产生显色反应，避免了酶标记二抗的使用，大大缩短了试验检测时间。

本发明的积极效果是

1、采用本发明的试剂盒进行检测可以消除动物种属差异，即只用HRP标记兔抗就可检测猪、牛、羊等血清样品中O型FMDV特异性抗体。

2、采用本发明的试剂盒在检测过程中，一步法加样，待检血清和HRP标记兔抗同时加入酶标板，然后显色读数，相比传统ELISA方法，检测时间大大缩短。

3、本发明用于包被的抗原为基因工程表达，相比传统全病毒灭活抗原，具有操作简单、成本低廉、纯度高、生物安全性好等优点。

4、使用兔血清多抗进行HRP标记，与单克隆抗体相比，所述多抗制备简单、成本低，具有多个抗原表位结合位点，与待检血清中的抗体具有很好的竞争活性。

附图说明