[发明专利]一种东方蜜蜂微孢子虫的LAMP检测引物及其检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及一种东方蜜蜂微孢子虫的LAMP检测引物及其检测试剂盒。

背景技术

东方蜜蜂微孢子虫是一种重要的蜜蜂真菌病原，广泛寄生于蜜蜂中肠组织，导致蜜蜂，尤其是西方蜜蜂罹患微孢子虫病，不仅缩短成年蜂个体寿命而且减弱蜂群群势，也影响蜂产品产量。与此同时，目前仍无一种有效防治蜜蜂微孢子虫病的药物。

在科学研究和养蜂生产中，通过蜜蜂感染微孢子虫后的行为和中肠组织形态变化与显微镜检的方法进行诊断，结果均相对滞后且不可靠、检测率低以及难以区别两种孢子（如镜检时可能与中肠中酵母细胞相混淆），电镜鉴定方法需要较高的专门操作技术和精密仪器，PCR检测需要较昂贵的仪器且检测时间较长，而LAMP检测成本低廉且无需复杂仪器。目前用PCR检测于两种蜜蜂微孢子虫病病原多是针对和16SrRNA（SSU）区序列（HigesM,MartinR,MeanaA.Nosemaceranae,anewmicrosporidianparasiteinhoneybeesinEurope.J.Inver.Pat.,2006,92(2):93-95；Chen,Yanping，Evans,JayD.，Smith,I.Bart，Pettis,JefferyS.Nosemaceranaeisalong-presentandwide-spreadmicrosporidianinfectionoftheEuropeanhoneybee(Apismellifera)intheUnitedStates.J.Inver.Pat.,2008,97(2):186-188.)，但Gisder等（GisderS,GenerschE.MoleculardifferentionofNosemaapisandNosemaceranaebasedonspecies-specificsequencedifferencesinaproteincodinggene.J.Inver.Pat.,2013,113(1):1-6.）报道了以16SrRNA为扩增序列检测两种蜜蜂微孢子虫病混合样时结果的不可靠性和低阳性率，及Erler等（ErlerS,LommatzschS,LattorffHM.Comparativeanalysisofdetectionlimitsandspecificityofmoleculardiagnosticmarkersforthreepathogens(Microsporidia,Nosemaspp.)inthekeypollinatorsApismelliferaandBombusterrestris.ParasitolRes,2012,110(4):1403-1410.）研究了前人报道的以ITS、SSU或16SrRNA为扩增区检测微孢子（Nosemaspp.）的PCR引物的特异性和灵敏性，部分引物在Nosemabombi、N.apis和N.ceranae三者间特异性存在交叉。RPB1基因（东方蜜蜂微孢子虫：Genbank登录号：XM_002995356.1）为靶序列设计的PCR引物检测东方蜜蜂微孢子虫并无非特异性条带及假阳性结果，也达到了很好的检测灵敏度。但是使用该基因设计的PCR引物对于东方蜜蜂微孢子虫检测操作步骤较多，且花费时间较长，不适于基层单位检测，也不利于生产上的广泛推广和使用。