[发明专利]一种将单磺酸四氮唑盐用于检测细胞活力的用途及方法

说明书

技术领域

本发明涉及医学生物检测技术领域，尤其涉及将单磺酸四氮唑盐用于检测细胞活力的用途及方法。

背景技术

NAD(P)⁺/NAD(P)H是一类重要的辅酶因子，存在于所有生物体中，包括细菌、放线菌、蓝藻、酵母菌、霉菌、真菌，一般动植物，其作为反应介质参与多种生命过程，包括能量代谢，线粒体功能，钙稳态，氧化应激，基因调节，免疫功能，老化和细胞死亡等。因此，一种基于细胞水平、灵敏低毒的检测方法来测定NAD(P)H或与其相关酶反应的变化，在科研、环境保持、医疗诊断等应用中具有关键的作用。

已报道有多种不同类型的四氮唑盐可测定细胞活力，例如TTC、MTT、WST-8。TTC(2,3,5-三苯基四氮唑)为脂溶性光敏感复合物，剧毒，高温会被严重破坏。MTT(3(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2 5-苯基-2-四氮唑)是一种接受氢离子的染料，它与TTC在检测细胞活性试验中生成的甲臜水溶性极差，需加有机试剂(如DMSO)进行溶解，易发生溶解不完全进而影响实验准确性，且吸取上清液操作时易带走部分细胞。另一方面，MTT除被线粒体脱氢酶类还原外，还可被多种其他物质还原，如血清白蛋白，L-抗坏血酸，β-巯基乙醇，谷胱甘肽s-转移酶等，而目前市面上最常用的试剂CCK8(WST-8)经实验证实也会被β-巯基乙醇、EGCG等抗氧化剂还原，导致检测细胞活力试验中出现假阳性。

专利CN201510757078.2-一类具有单磺酸苯基四氮唑结构的化合物及其应用提供了单磺酸四氮唑化合物的合成方法，简言之，在65℃下将4-硝基苯肼(0.958g)溶解于甲醇(22ml)中，在50℃下用2-甲酰基苯磺酸钠(1.188g)处理2小时。经处理后，得到橙红色固体肼，产率87％。在第二步中，将所得的肼(0.614g)溶于20ml甲醇中，与新鲜制备的2-甲氧基-4-硝基苯重氮盐(0.36g)和1mol/L氢氧化钠(0.9ml)在0℃下反应2小时，然后升温至25℃反应2hrs。后处理后，得到甲臜，产率85％。在第三步中，在0℃将甲臜(0.522g)溶于甲醇(18ml)，加入37％的HCl(2g)，用过氧化氢(2.27ml，20mM)氧化2hrs，然后在25℃过夜反应。后处理和硅胶柱纯化后，得到了四氮唑盐EZMTT，产率99％，纯度45％。

发明内容

单磺酸四氮唑盐作为一种新型的单磺酸四氮唑化合物，实验原理与WST-8类似：在电子耦合试剂1-methoxy PMS存在的情况下，可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物(formazan)，通过酶标仪测定450nm波长OD值。活细胞数量越多，则吸光度越高。单磺酸四氮唑盐相应的甲臜产物高度水溶、细胞毒性低、灵敏度高、具有抗氧化性药物筛选不产生假阳性，因此在药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验以及生物因子的活性检测等应用上具有广阔的前景。

利用新型单磺酸四氮唑盐试剂的颜色变化实时监测细胞活力，提供了一种细胞活力的检测方法。测试剂选用单磺酸四氮唑盐检测体系，在NAD(P)H水平及活细胞数量上呈现良好的线性剂量关系；测试剂通过单磺酸四氮唑盐反应物在450nm的吸光度值，得到EC₅₀曲线，进行细胞活力评价。

本发明的检测方法是一种基于细胞高度灵敏的检测方法。本发明方法中提供的单磺酸四氮唑盐细胞毒性小，适用于活细胞基础试验；单磺酸四氮唑盐试剂温和且检测后的细胞可经漂洗进一步用于后续实验；单磺酸四氮唑盐试剂不易与还原性物质反应，干扰小；该试剂适用范围广，包括环境微生物富集后的检测，藻类、真菌及动植物细胞活力的检测，细胞及组织病变的检测。

本发明针对现有技术的缺点，提供了一种细胞活力检测方法；包括如下内容：

一种将单磺酸四氮唑盐用于检测细胞活力的用途，其特征在于：所述的单磺酸四氮唑盐化学式为：

一种细胞活力的检测方法，所述的检测方法包括如下步骤：

步骤一、在培育好的含待测细胞的培养基中加入单磺酸四氮唑盐检测试剂，培育1小时以上；

步骤二、在450±20nm处测定其吸光度，得到标准曲线；通过观察待测细胞的剂量响应对细胞活力进行评价。

所述的单磺酸四氮唑盐检测试剂包括单磺酸四氮唑盐或含有培养基的单磺酸四氮唑盐与1-methoxy PMS。

优选地，所述的一种细胞活力的检测方法中的单磺酸四氮唑盐的浓度为0.1～10mM，1-methoxy PMS的浓度为5～25μM。