[发明专利]一种多重PCR引物及其在大菱鲆养殖过程中的应用

说明书

本发明涉及一种多重PCR引物及其在大菱鲆养殖过程中的应用。本发明提供的一种多重PCR引物，由嗜水气单胞菌特异性引物H、温和气单胞菌特异性引物S和舒伯特气单胞菌特异性引物Sc组成。采用该多重PCR引物在大菱鲆养殖过程中快速鉴定致病菌的方法如下：提取大菱鲆病灶部位细菌的总DNA；以所提取的DNA为模板，采用上述的多重PCR引物，进行PCR扩增；根据PCR扩增产物的琼脂糖凝胶呈像结果判断。本发明经过一次PCR反应可以同时检测三种大菱鲆养殖过程中常见的致病菌，表现出很强的特异性和灵敏性。在大菱鲆养殖过程中，一旦有被这三种气单胞菌感染的风险，即能够做到快速鉴定致病源，为养殖户挽回大量损失。

技术领域

本发明属于病原微生物检测领域，具体涉及一种大菱鲆养殖过程中常见的3种致病菌：嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、温和气单胞菌(Aeromonas sobria)和舒伯特气单胞菌(Aeromonas schubertii)的多重PCR检测方法。

背景技术

有“多宝鱼”之称的大菱鲆已被引进我国长达10年之久，凭借其优良的苗种，先进的创新模式和工业化养殖的潮流，逐渐成为全国引人注目的重要养鱼工业。这一全新产业的发展，对我国的水产经济拉动均有很大作用，并为我国北方沿海城市工业化养鱼的纵向发展奠定了雄厚的理论和实践基础。然而随着养殖规模的快速增长，养殖密度的增加，以及水体环境的恶化，一系列的疾病也随之而来。近年来在大菱鲆养殖过程中细菌性疾病的急剧爆发严重影响并制约了我国大菱鲆养殖产业的健康发展，给养殖户带来了巨大的经济损失。

发明内容

本发明的目的是提供一种对嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和舒伯特气单胞菌具有特异性强且灵敏性高的多重特异性引物。

本发明的另一目的是提供一种在大菱鲆养殖过程中，可快速鉴定致病源，为养殖户挽回经济损失的大菱鲆养殖过程中快速鉴定致病菌的多重引物PCR检测方法。

本发明采用的技术方案是：一种多重PCR引物，由嗜水气单胞菌特异性引物H、温和气单胞菌特异性引物S和舒伯特气单胞菌特异性引物Sc组成。

所述的嗜水气单胞菌特异性引物H的DNA序列为：

上游引物F1的序列为：CGACGTGTTTGGCGATATTTTTG

下游引物R1的序列为：GTCTTGGTCTTCTGGTAGCGA

所述的温和气单胞菌特异性引物S的DNA序列为：

上游引物F2的序列为：GCTGATTTTGGTGATGCGTTCA

下游引物R2的序列为：TACGTACAGATCCCCAGCCC

所述的舒伯特气单胞菌特异性引物Sc的DNA序列为：

上游引物F3的序列为：GGGCCCGTTATGACCAGTTT

下游引物R3的序列为：AGGAGTGATCTTGAGCTTGACC。

优选的，上述的多重PCR引物，所述的嗜水气单胞菌为Aeromonas hydrophila，温和气单胞菌是Aeromonas sobria，舒伯特气单胞菌为Aeromonas schubertii。

一种大菱鲆养殖过程中快速鉴定致病菌的多重PCR检测方法，方法如下：

1)提取大菱鲆病灶部位细菌的总DNA；

2)以所提取的DNA为模板，采用上述的多重PCR引物，进行PCR扩增；