[发明专利]利用重组大肠杆菌以甘油为碳源发酵生产琥珀酸的方法

说明书

本发明公开一种利用重组大肠杆菌以甘油为碳源发酵生产琥珀酸的方法，在特定条件下增殖具有高效转化甘油能力的重组大肠杆菌达到高密度，然后在厌氧条件下快速将甘油转化为琥珀酸，所述特定条件是指培养基同时含有甘油和乙酸或其盐作为碳源，发酵初始阶段采用常规有氧培养，维持溶氧水平在10％以上，在菌体达到足够浓度后进入诱导阶段，加入IPTG诱导磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的表达，并限制氧的供应，保持整个诱导阶段溶氧不高于1％。本发明的优点在于：甘油作为生物柴油的副产物，其价格低廉，合成琥珀酸所需的还原力足够，且本发明提供的方法发酵时间短，琥珀酸得率高，具有积极的工业应用前景。

技术领域

本发明涉及一种利用重组大肠杆菌以甘油为碳源发酵生产琥珀酸的方法。

背景技术

琥珀酸是一种重要的化工原料，是美国能源部在2004年公布的利用可再生资源生产的最有潜力的12种化学砌块之一。它可以取代很多基于苯和石化中间产物的商品，可以减少超过250种苯基化学制品的生产和消耗过程中所产生的污染。琥珀酸作为C4平台化合物，可以合成一些重要的化工产品如丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯、n-甲基吡咯烷酮、2-吡咯烷酮等。由于可生物降解聚酯等新的下游应用领域的拓展，对琥珀酸的需求量在未来将有很大的增长。现有研究多集中于以糖类为碳源生物合成琥珀酸。

甘油是生物柴油的一种副产物，每生产9kg的生物柴油，便会产生约1kg的粗甘油。随着生物柴油产业的发展，粗甘油的产量也越来越多，其价格也越便宜，有效地将甘油转化为更高附加值的产品显得十分迫切。

厌氧发酵的优点是碳源能够有效地转变为代谢产物，但是大肠杆菌在厌氧条件下且不存在外源电子受体时，不能代谢甘油。近年来有研究发现(Biotechnology andBioengineering,2006,94(5):821-829)，在控制pH的条件下，大肠杆菌在厌氧时可以代谢甘油。Zhang等(Applied and Environmental Microbiology,2010,76(8):2397-2401)通过对大肠杆菌进行代谢改造，使重组大肠杆菌能够在厌氧条件下将甘油转化为琥珀酸，6天厌氧发酵生产的琥珀酸浓度达到13.2g/L。Blankschien等(Metabolic Engineering,2010,12(5):409-419)阻断了大肠杆菌一系列琥珀酸竞争性代谢途径，并引入外源基因编码的丙酮酸羧化酶，构建的重组菌在72小时内琥珀酸产量达到20g/L。不过，大肠杆菌以甘油为碳源进行发酵生产琥珀酸时，代谢甘油慢、琥珀酸产量低的缺点依旧未能得到解决。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用重组大肠杆菌以甘油为碳源发酵生产琥珀酸的方法。

为实现以上目的，本发明公开以下技术方案：一种利用重组大肠杆菌以甘油为碳源发酵生产琥珀酸的方法，其特征在于，所述方法是指在特定条件下增殖具有高效转化甘油能力的重组大肠杆菌达到高密度，然后在厌氧条件下快速将甘油转化为琥珀酸，所述特定条件是指培养基同时含有甘油和乙酸或其盐作为碳源，发酵初始阶段采用常规有氧培养，维持溶氧水平在10％以上，在菌体达到足够浓度后进入诱导阶段，加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的表达，并限制氧的供应，保持整个诱导阶段溶氧不高于1％。

作为一个优选方案，甘油在总碳源中比例为60％-80％。

作为一个优选方案，所述菌体达到足够浓度是指菌体密度不低于4-6g干重/L。

作为一个优选方案，诱导阶段溶氧为0—0.1％。

作为一个优选方案，诱导结束后利用CO₂维持厌氧状态。

作为一个优选方案，厌氧阶段的pH通过加入碱式碳酸镁维持在6.3以上。

作为一个优选方案，所述重组大肠杆菌为缺失与琥珀酸生产竞争的一个或多个代谢支路的关键基因，并过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因。