[发明专利]一种酶法制备D-塔格糖的方法

说明书

本发明公开了一种酶法制备D‑塔格糖的方法，包括1)单独构建含有半乳糖醇脱氢酶基因的工程菌以及含有NADH氧化酶基因的工程菌或者构建含有半乳糖醇脱氢酶基因与NADH氧化酶基因共表达的工程菌；2)将构建的工程菌进行发酵获得含有半乳糖醇脱氢酶、NADH氧化酶的整细胞；3)以含有半乳糖醇脱氢酶、NADH氧化酶的整细胞或半乳糖醇脱氢酶、NADH氧化酶的游离酶为催化剂，在弱碱性条件下，NAD+作为氢受体，催化半乳糖醇制备D‑塔格糖。本发明与传统依赖L‑阿拉伯糖异构酶的生产方法相比，其对底物的转化率高(>99.0％)、产物分离容易，并且本发明的方法中所使用的辅酶循环系统辅产物为水，对主产物分离纯化无影响。

技术领域

本发明属于生物化工领域，具体涉及一种基于半乳糖醇脱氢酶与NADH氧化酶双酶耦合的D-塔格糖生产方法。

背景技术

D-塔格糖(D-tagatose)为六碳糖，半乳糖的酮糖形式，果糖的差向异构体，其甜度为蔗糖的92，但热量仅为蔗糖的38％。近年来，随着生活水平的提高以及糖尿病、肥胖等疾病的普遍化，将D-塔格糖作为功能性甜味剂以取代蔗糖的呼声日益高涨。D-塔格糖是天然存在的一种稀有单糖，在乔木分泌的树胶中，灭菌后的牛奶、热可可、奶酪和芝士等中均有发现，但很难从自然界中大规模直接获取。

目前工业上，D-塔格糖的生产主要采用以碱金属盐作为催化剂的化学法或依赖L-阿拉伯糖异构酶的生物法将D-半乳糖异构为D-塔格糖。Beadle等于1991年发明了利用Ca(OH)2异构D-半乳糖生产D-塔格糖的工艺，其原料D-半乳糖可以通过水解乳糖或者更为廉价的乳清(制作乳制品产生的废料)得到，工艺成本能被市场接受(Beadle J.R.et al.,WO92-12263,1992)。然而，这种方法的副产物众多，下游分离困难，同时伴有严重的废水污染。1993年，Cheetham等发现L-阿拉伯糖异构酶(简称L-AI酶，EC 5.3.1.4)能够催化D-半乳糖生成D-塔格糖；此后的20多年，通过对不同来源的L-AI酶进行异源表达、性质表征以及基因工程改造，学者们也已筛选到了多种适应工业上严苛生产条件的L-AI酶。但该项技术最大的瓶颈问题是：转化率受到化学平衡的限制，D-半乳糖的理论转化率仅在40％左右，需要增加下游分离等配套环节，加大了投入也提高了生产成本。

半乳糖醇脱氢酶(galactitol 2-dehydrogenase,EC 1.1.1.16)，现已发现存在于Aspergillus niger、Burkholderia cepacia、Rhodobacter sphaeroides、Pseudomonassp.等多种微生物中，能以NAD+作为氢受体，将底物半乳糖醇C2位的羟基氧化为酮基生成D-塔格糖。原料半乳糖醇价格低廉，是木糖醇生产过程中的副产品()，但这一过程要实现工业化亟需解决的关键技术难点是：1、开发具有工业化应用前景的半乳糖醇脱氢酶及其工程菌；2、建立适用于产业化放大的辅酶高效原位再生的体系。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种半乳糖醇脱氢酶基因及其工程菌，该基因编码的半乳糖醇脱氢酶能催化半乳糖醇与D-塔格糖相互转化，并将其与NADH氧化酶偶联建立高效的辅酶再生系统应用于D-塔格糖的制备，如图1所示。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：一种酶法制备D-塔格糖的方法，包括下列步骤：

(1)单独构建含有半乳糖醇脱氢酶基因的工程菌以及含有NADH氧化酶基因的工程菌或者构建含有半乳糖醇脱氢酶基因与NADH氧化酶基因共表达的工程菌；

(2)将上述构建的工程菌进行发酵获得含有半乳糖醇脱氢酶、NADH氧化酶的整细胞；

(3)以含有半乳糖醇脱氢酶、NADH氧化酶的整细胞或半乳糖醇脱氢酶、NADH氧化酶的游离酶为催化剂，在弱碱性条件下，NAD+作为氢受体，催化半乳糖醇制备D-塔格糖。