[发明专利]三磷酸腺苷的纯度检测方法

权利要求书

1.一种三磷酸腺苷的纯度检测方法，其特征在于，包括下述步骤：对ATP标准物质中的水分进行定量检测得到水分含量，对ATP标准物质中的无机杂质进行定量检测得到无机杂质含量，用高效液相色谱检测ATP，并用面积归一化法计算ATP含量，然后通过下述公式计算出ATP标准物质中三磷酸腺苷的纯度：

三磷酸腺苷的纯度＝(100％-水分含量-无机杂质含量)×ATP含量；

所述的ATP标准物质由ATP原料经纯化步骤得到，

所述的纯化步骤包括如下：

(1)中压制备色谱条件：中压制备色谱柱的规格为10μm，30*250mm，柱温为3～8℃，洗脱溶剂为甲醇-0.2mol/L磷酸盐缓冲液，体积比为15:85，流速40～50ml/min；进样为40～50mg/ml的ATP二钠水溶液，检测波长259nm，运行时间为20min；所述中压制备色谱柱为YMC C18柱；

(2)样品纯化

调节柱温为3～8℃，用体积百分比浓度为15％的甲醇水溶液冲洗中压制备色谱柱后，再用步骤(1)中的洗脱溶剂平衡制备柱，将ATP原料形成的40～50mg/ml水溶液注入中压制备分离系统，收集峰高1500mV以上洗脱液，冷冻避光保存；

(3)Na⁺平衡和脱盐

用体积百分比浓度为15％甲醇水溶液洗去色谱柱中缓冲盐，调节柱温为5℃，再用体积百分比浓度为8％甲醇水溶液平衡中压制备分离系统，将冷冻保存的洗脱溶液全部注入中压制备分离系统，用体积百分比浓度为8％甲醇-pH为6.0磷酸钠缓冲溶液进行钠离子平衡，至洗脱液的pH为6.0，再用体积百分比浓度为8％甲醇水溶液洗涤去除缓冲盐离子，再用甲醇洗脱，收集峰高1500mV以上洗脱液；

(4)样品干燥

蒸馏去除甲醇，冷冻干燥，即得三磷酸腺苷标准物质。

2.如权利要求1所述的纯度检测方法，其特征在于，所述的纯化步骤 包括如下：

(1)中压制备色谱条件：中压制备色谱柱的规格为10μm，30*250mm，柱温为5℃，洗脱溶剂为甲醇-0.2mol/L磷酸盐缓冲液，体积比为15:85，流速40～50ml/min；进样为40mg/ml的ATP二钠水溶液，检测波长259nm，运行时间为20min；

(2)样品纯化

调节柱温为5℃，用体积百分比浓度为15％的甲醇水溶液冲洗中压制备色谱柱后，再用步骤(1)的洗脱溶剂平衡制备柱，将ATP原料形成的40mg/ml水溶液注入中压制备分离系统，收集峰高1500mV以上洗脱液，冷冻避光保存；

(3)Na⁺平衡和脱盐

用体积百分比浓度为15％甲醇水溶液洗去色谱柱中缓冲盐，调节柱温为5℃，再用体积百分比浓度为8％甲醇水溶液平衡中压制备分离系统，将冷冻保存的洗脱溶液全部注入中压制备分离系统，用体积百分比浓度为8％甲醇-pH为6.0磷酸钠缓冲溶液进行钠离子平衡，至洗脱液的pH为6.0，再用体积百分比浓度为8％甲醇水溶液洗涤去除缓冲盐离子，再用甲醇洗脱，收集峰高1500mV以上洗脱液；

(4)样品干燥

蒸馏去除甲醇，冷冻干燥，即得三磷酸腺苷标准物质。

3.如权利要求1所述的纯度检测方法，其特征在于，在对水分进行定量检测前，还对ATP标准物质进行定性鉴定，所述的定性鉴定采用下述步骤：使用核磁共振波谱仪对ATP标准物质中的碳谱和氢谱进行扫描，得到主成分的结构；使用有机元素分析仪对ATP标准物质中的碳、氢、氮元素含量进行测定，与理论值进行比对。

4.如权利要求1所述的纯度检测方法，其特征在于，所述的水分进行定量检测采用卡尔费休法进行检测，所述的ATP标准物质中的水分含量<1％，该水分含量不计结晶水。

5.权利要求4所述的纯度检测方法，其特征在于，所述的ATP标准物质中的水分含量为0.2％～0.5％。

6.如权利要求1所述的纯度检测方法，其特征在于，所述的无机杂质包括阳离子杂质和阴离子杂质，其中对阳离子杂质进行定量检测使用电感耦合等离子体发射光谱进行检测；其中对阴离子杂质进行定量检测使用离子色谱进行检测。

7.如权利要求1所述的纯度检测方法，其特征在于，所述的高效液相色谱中，在波长259nm处进行紫外检测，然后使用面积归一化法进行计算ATP含量。