[发明专利]一种用于桑树植原体基因组的纯化方法

说明书

一种用于桑树植原体基因组的纯化方法，利用植原体具有细胞膜且其基因组为半自主复制的特点，采用DNA甲基化结合蛋白，从纯化的感染植原体的桑树全基因组中去除桑树基因组，通过半定量和定量PCR均证实所获的DNA纯度较高，浓度较大的桑树植原体基因组DNA，解决了木本植物植原体含量低，脉冲电泳纯化困难的问题，并利用定量PCR对本发明效果进行了验证，所获得的植原体基因组浓度和比例较高，可以用于PCR实验和高通量测序。

技术领域

本发明涉及一种用于桑树植原体基因组的纯化方法，特别涉及一种用于直接测序等需要高纯度基因组的桑树植原体DNA的纯化方法。

背景技术

1967年土居等首次发现桑树黄化型萎缩病、泡桐丛枝病等多种植物的丛枝病均系植物类菌原体寄生所引起，1974年我国通过电子显微镜研究，在发生萎缩病的桑树韧皮部筛管内观察到类菌原体，1998年邱并生等分别扩增了桑黄化型萎缩病和萎缩型萎缩病16SRNA片段，按照植原体的分子分类系统，初步确定两种病害的植原体隶属于翠菊黄化组。1992年类菌原体被正式命名为植原体(Phytoplasma)。植原体归属于柔膜菌属，细胞通常呈圆形或椭圆形，没有细胞壁，在细胞质外具有单层膜，细胞质内有颗粒状的核糖体、可溶性蛋白质、RNA及代谢物等，基因组是双链闭合环状的DNA，目前已知植原体的种类有12个类群，25个亚群。桑树植原体属于翠菊黄化病组B亚组。由于植原体不能进行人工培养，所以植原体全基因组序列对于植原体研究的重要性，许多实验室用不同的方法对植原体进行全基因组测序。

在测序技术非常成熟的今天，分离技术是其基因组学研究的瓶颈，目前植原体基因组的纯化方法有先组织浸提液简单过滤法，差速离心法，密度梯度离心法，植株韧皮部汁液渗出发和植物组织冷冻法，这些方法的分离效果均不够理想。由于这些提取液的渗透压难以达到韧皮部的环境，而植原体有缺乏细胞壁，导致渗透压稍有变化就会引起植原体个体的崩解。PFGE是一种分离大分子DNA的方法。在普通的凝胶电泳中，大的DNA分子（>10kb）移动速度接近，很难分离形成足以区分的条带。在脉冲场凝胶电泳中，电场不断在两种方向（有一定夹角，而不是相反的两个方向）变动。DNA分子带有负电荷，会朝正极移动。相对较小的分子在电场转换后可以较快转变移动方向，而较大的分子在凝胶中转向较为困难。因此小分子向前移动的速度比大分子快。脉冲场凝胶电泳可以用来分离大小从10kb到10Mb的DNA分子。但该方法对于植原体的基因组含量要求较高，而且对于木质化高的植物非常不适用，一般是利用菟丝子转到草本植物中再进行，这大大增加了纯化难度。而利用酶促反应从病株总基因组中直接纯化植原体的方法未见报道。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种用于桑树植原体基因组的纯化方法，加快桑树植原体的全基因组序列的解析，首先对桑树植原体的分子生物学地位和结构特点进行分析，桑树植原体虽然没有细胞壁，但是具有细胞膜，属于半自主复制，这样就可以避免被桑树的DNA甲基化酶进行甲基化修饰，同时植原体的GC含量在40%左右，偏低，也可以有效避免被甲基化的比例，同时，已有的植原体染色实验证实植原体主要存在于桑树的韧皮部，所以本发明利用从桑树韧皮部提取全基因组DNA，然后利用甲基化DNA结合蛋白，去除桑树的宿主DNA，就可以获得纯度较高的桑树植原体基因组。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种用于桑树植原体基因组的纯化方法，包括以下步骤：

步骤一、样品处理，利用解剖刀取桑树感染植原体的病株的枝条的韧皮部1g，放入干净的研钵中，加入液氮冷冻后研磨均匀；