[发明专利]一种基于β-葡萄糖苷酶的工程菌及其实现方法

说明书

技术领域

本发明属于酶基因工程及酶工程领域，尤其是涉及一种基于β-葡萄糖苷酶的工程菌及其实现方法。

背景技术

纤维素酶是能将纤维素水解成葡萄糖的一组酶的总称，分为内切葡聚糖酶(endo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.3.4)、外切葡聚糖酶(exo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(β-D-glucosidase，EC3.2.1.21)。尽管β-葡萄糖苷酶不直接参与纤维素的降解，但是在纤维素降解过程中消除纤维二糖抑制内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶对纤维素降解有重要作用。

据报道，全球每年通过光合作用产生的纤维素高达1.55×10⁹t，其中89％尚未被人类利用，而有研究表明，纤维素是生产新型生物乙醇的潜在的最佳原料。但是，在工业生产中，如何高效地将纤维物质降解成葡萄糖(glucose)、木糖(xylose)等可发酵糖是生物乙醇生产过程中最重要的技术瓶颈，倍受科研爱好者的关注。

目前工业以及农业上对β-葡萄糖苷酶的应用主要集中在如下几个方面。

能源领域：随着温室效应、赤潮、雾霾、石油枯竭现象的加重，人们开始探寻新型生物能源。其中，生物乙醇被认为是解决能源短缺，环境污染的主要原料之一。

畜牧领域：畜禽粗饲料中含有大量的纤维素，除了某些反刍以及单胃草食动物具有分解纤维素的能力，大部分的家畜家禽不具备此能力。β-葡萄糖苷酶作为新型饲料添加剂，能够分解复杂的纤维物质，生成容易消化吸收的小分子营养物质，能够促进食物在畜禽胃肠道的消化吸收，提高饲料的利用效率。

此外，β-葡萄糖苷酶在食品、造纸、洗涤、纺织等领域也有广泛的应用。

目前，各种纤维素酶基因均已在细菌中发现并被克隆。与真核生物纤维素酶基因相比，细菌纤维素酶基因具有不含内含子、易克隆、易表达及种类多等优势。微生物产生的β-葡萄糖苷酶种类较多，不同微生物来源的β-葡萄糖苷酶的性质差异较大，从而导致各具特色的应用范围，由于草食动物摄食种类广泛的植物，使存在其胃肠道中的微生物具备了相应的特殊生理、代谢特点，能产生各种酶类以分解食物中的淀粉、果胶、纤维素、蛋白质和脂肪等物质。因此，动物胃肠道微生物本身是一个巨大的、未开发的酶基因资源库，蕴涵着大量潜在的酶基因资源。因此，以动物胃肠道中的微生物为对象，对大分子多糖物质的分解利用机制进行探究，发现全新的纤维素酶基因序列并通过克隆和转基因的方式对目的基因进行外源表达，对新型纤维素酶制剂的开发及生产具有重大意义。

发明内容

针对以上技术问题，本发明的目的在于提供一种基于β-葡萄糖苷酶的工程菌及其实现方法，从乌骨绵羊粪便中提取高活性β-葡萄糖苷酶的目的菌株，并对目的菌株鉴定到种的分类学水平，预测出高活性β-葡萄糖苷酶编码基因的全长序列，构建出具有编码基因的重组质粒，并利用重组质粒转化到BL21(DE3)得到重组纤维素酶基因工程菌。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种基于β-葡萄糖苷酶的工程菌，所述的工程菌为外源表达β-葡萄糖苷酶的大肠杆菌，其中，所述的β-葡萄糖苷酶，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。

本发明还公开了β-葡萄糖苷酶的编码基因，其序列如SEQIDNO.2所示。

本发明的工程菌含有β-葡萄糖苷酶重组大肠杆菌表达载体，该载体包含如SEQIDNO.2的β-葡萄糖苷酶的编码基因。

上述基于β-葡萄糖苷酶的工程菌的实现方法，其具体步骤为:

1)高活性β-葡萄糖苷酶生产菌株筛选

通过功能筛选培养基从乌骨绵羊粪便中筛选出具有高活性β-葡萄糖苷酶的菌株，进行复筛后纯培养，得到目的菌株；

2)目的菌株种属鉴定

a.首先对目的菌株种进行形态学鉴定，确认目的菌株种为细菌；

b.通过16SrDNA分子鉴定方法将目的菌株种鉴定到属分类学水平；