[发明专利]一种巴西绿蜂胶质量控制方法

说明书

技术领域

本发明属于蜂胶质量控制领域，涉及一种巴西绿蜂胶质量控制方法。

背景技术

巴西绿蜂胶采自巴西东南部和中西部地区，其植物来源是Baccharis dracunculifolia DC.，是目前国内外商业上最流行、研究最多的蜂胶类型之一，现已广泛应用于保健食品中来改进人类健康和预防疾病。

巴西绿蜂胶进口至中国已有十余年历史，由于缺少质量评价方法，只能参照中国蜂胶的国家标准，以总黄酮含量作为质控指标。而巴西绿蜂胶主要成分为异戊烯苯丙类和p-香豆酸的异戊烯基衍生物，黄酮类化合物含量较低。显然以总黄酮含量为指标不适合巴西绿蜂胶质量控制。

目前关于巴西绿蜂胶中黄酮类、酚酸类的含量检测以及指纹图谱的研究较多。然而，在不同的检测条件下所用指标及建立的指纹图谱各不相同，再加上蜂胶中不同化学成分所发挥的药理活性并不相同，目前，巴西绿蜂胶的质控方法与其疗效无相关性，难以达到确保蜂胶有效性和药效稳定性的目的。

发明内容

本发明的目的是提供一种巴西绿蜂胶质量控制方法，通过以下步骤实现：

1.蜂胶样本制备

对供试样品进行冷冻粉碎后，用70～95％乙醇超声提取15～45min，料液比为1:10～30，反复提取3次，合并滤液，经冷冻除蜡后用95％的乙醇定容至50mL，经微孔膜过滤得R1检测样本液；

2.高效液相色谱法检测

检测条件：Sepax HP-C18(150mm*4.6mm,5μm)；流动相：甲醇-0.1％乙酸；流速：1.0mL/min；波长：280nm，柱温：33℃，进样量：5μL，优化后的梯度洗脱程序为：0-10min，15-25％甲醇；10-25min，25-40％甲醇；25-55min，40-60％甲醇；55-75min，60-75％甲醇；75-90min，75-85％甲醇；

3.质量评价

根据标准曲线和峰面积，计算出绿原酸、咖啡酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4,5-三咖啡酰奎宁酸和阿替匹林C的含量，以这6个成分的含量高低评价巴西绿蜂胶的质量优劣，即这6个成分的含量总和大于10％为优质蜂胶，小于6％为劣质蜂胶。

本发明的另一个目的是提供所述的方法在评价巴西绿蜂胶质量中的应用。所述的巴西绿蜂胶质量评价方法所采用的活性指标成分为绿原酸、咖啡酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4,5-三咖啡酰奎宁酸和阿替匹林C，当这6个成分的含量总和大于10％为优质蜂胶，小于6％为劣质蜂胶。

本发明克服巴西绿蜂胶质量控制中采用总黄酮或单个黄酮或酚酸的仅以化学成分信息进行质控的弊端，提供了一种以抗氧化活性成分来评价巴西绿蜂胶质量优劣的评价方法。与现有的巴西绿蜂胶质量控制方法相比，本发明具有下述特点：(1)明确巴西绿蜂胶抗氧化活性成分，以抗氧化活性成分为指标能够反应巴西绿蜂胶的抗氧化活性强弱。(2)以抗氧化活性成分为指标，更能真实地体现巴西绿蜂胶的药理活性。本发明将巴西绿蜂胶化学成分与抗氧化活性相结合，阐明了巴西绿蜂胶抗氧化物质基础，避免了某些主要成分并未发挥较强的药理活性的弊端，更能真实反应巴西绿蜂胶的抗氧化活性。本发明方法克服现有巴西绿蜂胶以总黄酮为质控指标的不合理性，以及克服多个黄酮或酚酸类含量检测与活性无相关性等缺陷，为巴西绿蜂胶质量控制提出一种新的方法。

附图说明

图1是巴西绿蜂胶与DPPH自由基反应前(a)与反应后(b)HPLC对比模式图谱：1、绿原酸；2、咖啡酸；3、3,5-二咖啡酰奎宁酸；4、4,5-二咖啡酰奎宁酸；5、3,4,5-三咖啡酰奎宁酸；6、阿替匹林C。

具体实施方式

本发明结合具体实施例作进一步的说明。

实施例1

(1)蜂胶样本制备

取不同批次的3个巴西绿蜂胶样，冷冻粉碎后，用95％乙醇超声提取30min，料液比为1:15，反复提取3次，合并滤液，经冷冻除蜡后用95％的乙醇定容至50mL，经微孔膜过滤分别得S1、S2、S3检测样本液。

(2)高效液相色谱检测

条件：Sepax HP-C18(150mm*4.6mm,5μm)；流动相：甲醇-0.1％乙酸；流速：1.0mL/min；波长：280nm。柱温：33℃。进样量：5μL。优化后的梯度洗脱程序为：0-10min，15-25％甲醇；10-25min，25-40％甲醇；25-55min，40-60％甲醇；55-75min，60-75％甲醇；75-90min，75-85％甲醇。