[发明专利]一种枯草芽孢杆菌发酵生产启动子及其应用方法

说明书

本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌发酵生产启动子及其应用方法。本发明所述启动子的碱基序列中含有如SEQ ID NO.1所示的分离的多核苷酸序列。本发明的发明人，将所述启动子与GFP连接，转化枯草芽孢杆菌,检测启动子对外源基因（或蛋白）表达的影响。通过检测GFP的表达结果证明，该启动子具有启动子的活性，并受工业生产培养基PPB诱导活性增强。此外，本发明启动子与其他启动子进行比较，所诱导表达的GFP量比其他启动子高65%~114%，适用于外源蛋白或多肽在微生物的重组生产，并具有受诱导可调控的活性特征。

技术领域

本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌发酵生产启动子及其应用方法。

背景技术

启动子为RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列。启动子是基因(gene)的一个组成部分，控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度。启动子(Promoters)就像“开关”，决定基因的活动。既然基因是成序列的核苷酸(nucleotides)，那么启动子也应由核苷酸组成。启动子本身并不控制基因活动，而是通过与称为转录(transcription)因子的这种蛋白质(proteins)结合而控制基因活动的。转录因子就像一面“旗子”，指挥着酶(enzymes)(RNA聚合酶polymerases)的活动。这种酶指导着RNA复制。

启动子位于结构基因5’端上游的一段DNA序列，能够指导全酶(holoenzyme)同模板正确结合，活化RNA聚合酶，启动基因转录。全酶是指酶蛋白及其辅酶构成的有功能的复合物。

随着生物工程技术的发展，越来越多的微生物发酵的方法应用于化学品、酶蛋白以及药剂的生产。其中，枯草芽孢杆菌由于其安全无毒、遗传背景清晰、分泌表达水平高等诸多优点，而成为工业用理想的宿主细胞。枯草芽孢杆菌中表达异源蛋白需要各种元件，其中，启动子对于表达水平的影响至关重要。目前成功用于枯草芽孢杆菌表达平台的启动子主要有P43、PamyQ、Pspac、PxylA等，这些启动子在实验室的富集培养基中表现良好，但鲜见它们被用于酶蛋白的工业放大生产。因此，有必要找到更高效的、适合于工业培养基生产表达的启动子，以适应发酵对表达水平越来越高的要求。

绿色荧光蛋白基因gfp可以作为启动子的一个报告基因，构建于启动子的下游，绿色荧光蛋白GFP的有无，表征启动子的作用；绿色荧光蛋白GFP的亮度，即绿色荧光蛋白GFP的产量，在同等条件下表征启动子的强弱。在启动子筛选或启动子功能比较中，可以用GFP的表达水平作为鉴定的标准。

发明内容

为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种枯草芽孢杆菌发酵生产启动子及其应用方法。

为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸的碱基序列含有如SEQ ID NO.1所示序列。

优选地，所述分离的多核苷酸序列的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：