[发明专利]根特异性表达AhMtan启动子及其应用

说明书

本发明涉及根特异性表达AhMtan启动子及其应用，属于生物技术领域。根特异性表达启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示。本发明克隆花生根特异启动子，并通过截短实验确定启动子核心区域，验证各启动子的功能，为我国花生生物技术应用与发展奠定基础；为获得双价抗蛴螬花生品种提供高效、稳定、特异表达的启动子提供重要分子基础。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及根特异性表达启动子，其克隆、功能验证其应用。

背景技术

栽培花生(Arachis hypogaea L.)属于豆科作物，是世界重要的油料作物和经济作物，2015年，我国花生产量达1670万吨，居世界首位。花生的产量受到一些生物和非生物胁迫的影响，尤其是地下害虫、真菌、细菌等。近年来花生田地下害虫发生猖獗，严重影响了花生的产量和品质，造成花生大面积减产。

地下害虫是指生活史中某一阶段危害植物近土表主茎、根、种子的杂食性害虫，造成植物根系受损，影响植物吸收水分和无机盐，导致植物生长迟缓，甚至死亡。地下害虫的种类很多，主要有蛴螬、蝼蛄、金针虫等。其中蛴螬是危害我国主要的地下害虫，也是重要的世界性害虫，在印度、日本、美国等国都曾造成作物的减产，危害玉米、花生、甘薯、大豆、李子等。

蛴螬是鞘翅目金龟子科(Scarabaeoidae)幼虫的总称，以植食性蛴螬危害最为广泛。一般造成的花生减产为1～2成，严重地块达5成以上，甚至颗粒无收。山东新泰市农业局数据显示，2008～2011年期间花生荚果平均受害率分别为15％、25％、28％、35％，呈逐年增加趋势，个别地块因蛴螬危害几乎绝产，造成重大的经济损失。2008年，贵州高尔夫球场蛴螬暴发成灾，草坪草失绿、萎蔫、根系坏死，导致草坪草大片枯死。

目前，主要用物理防治、化学防治和生物防治三种手段防治地下害虫蛴螬。物理防治主要是根据成虫的趋光性，用黑光灯诱杀成虫，但对幼虫没有什么效果。进行化学防治时，使用呋喃丹、乐斯本、辛硫林、噻虫胺化学药剂进行的防治，虽然毒杀蛴螬的效果很好，但同时也存在一定的弊端。首先，化学药剂严重的污染环境；其次，有些杀虫剂是高残留的，直接危害到人类的健康，尤其是施用的农民，更有致残甚至致死的情况。

用于生物防治的主要有线虫、病原真菌、病原细菌等。虽然对这些生物的防治有较长的研究历史，但并没有广泛的应用。究其原因，一方面有些生物本身具有致病性，导致花生染病；另一方面，如线虫的批量生产、储藏温度、储藏时间等都会对防治效果产生影响，病原真菌及细菌中的大部分容易受到环境的影响等。为实现蛴螬的绿色防控，急需开辟新的防治途径。随着生物技术的发展，应用分子手段培育抗虫害花生新品种，已成为目前新的防治途径。

以生物防治、抗性作物品种及通过轮作控制害虫生长环境为基础的综合害虫防治，已经在世界范围广泛应用，这主要归功于抗性作物品种的发展，而生物技术在培育抗性品种方面起到了重要的作用。抗虫基因主要有三大类，植物源杀虫基因(豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)基因，植物次生代谢物等)；动物源杀虫基因(几丁质酶基因，蜘蛛毒素基因等)；微生物源杀虫基因(苏云金芽胞杆菌(Bt)杀虫晶体蛋白基因，胆固醇氧化酶基因等)。国内外对抗虫害转基因花生的研究起步较晚，目前应用的抗虫基因也主要集中在微生物源杀虫基因。

目前，组织特异性启动子被广泛应用于基因工程。通过基因工程手段将组织特异表达的启动子与抗病基因相连，使抗病基因在特定部位定时、高效表达，达到防治病虫害的目的，为农民提供更多的生态安全和安全管理策略的机会。