[发明专利]一种用于糖原合成激酶3β基因突变检测的试剂及应用

权利要求书

1.一种用于糖原合成激酶3βGSK3β基因突变检测的试剂，其特征在于，包括用于阻断野生型GSK3β基因扩增的野生型PNA序列、用于特异性扩增Y140C、E249K突变型GSK3β基因序列的一组引物对及突变型PNA荧光探针：

所述检测GSK3β基因Y140C突变正向引物如序列表中SEQIDNO.1；

所述检测GSK3β基因Y140C突变反向引物如序列表中SEQIDNO.2；

所述检测GSK3β基因E249K突变正向引物如序列表中SEQIDNO.3；

所述检测GSK3β基因E249K突变反向引物如序列表中SEQIDNO.4；

所述检测GSK3β基因Y140C突变PNA荧光探针如序列表中SEQIDNO.5；

所述检测GSK3β基因E249K突变PNA荧光探针如序列表中SEQIDNO.6；

所述特异性结合包含GSK3β基因140密码子野生型PNA序列如序列表中SEQIDNO.7；

所述特异性结合包含GSK3β基因249密码子野生型PNA序列如序列表中SEQIDNO.8；

所述PNA荧光探针的5'端的荧光报告基团为：FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5，3'端的淬灭基团为：TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。

2.根据权利要求1所述的用于糖原合成激酶3βGSK3β基因突变检测的试剂，其特征在于，所述的检测试剂还包括PCR反应液、140密码子和249密码子突变型参考品、140密码子和249密码子野生型参考品，其中PCR反应液包括：DEPC水、具有5'→3'外切活性的DNA聚合酶、dNTPs、10×PCRBuffer、RNASIN、M-MLV逆转录酶、oligo(dT)和含Mg离子的溶液；所述140密码子突变型参考品为含SEQNO.9的重组质粒DNA；所述140密码子野生型参考品为含SEQNO.10的重组质粒DNA；所述249密码子突变型参考品为含SEQNO.11的重组质粒DNA；所述249密码子野生型参考品为含SEQNO.12的重组质粒DNA。

3.根据权利要求2所述的用于糖原合成激酶3βGSK3β基因突变检测的试剂，其特征在于，所述具有5'→3'外切活性的DNA聚合酶为Taq酶。

4.根据权利要求3所述的用于糖原合成激酶3βGSK3β基因突变检测的试剂，其特征在于，所述PCR反应液各组分在PCR扩增反应体系中的终浓度为：Taq酶0.01U/μL～0.05U/μL，dNTPs0.2～0.6mM，10×PCRBuffer1×，RNASIN40U/μL～60U/μL，M-MLV逆转录酶200U/μL～320U/μL，MgCl₂1.5～5.0mM，溶剂为DEPC水；所述正向引物的终浓度为0.05～0.9μM，所述反向引物的终浓度为0.05～0.9μM，所述oligo(dT)终浓度为0.05～0.9μM，所述互补PNA序列终浓度为0.05～0.9μM，所述荧光探针的终浓度为0.05～0.9μM。

5.根据权利要求1-4所述的用于糖原合成激酶3βGSK3β基因突变检测的试剂，其特征在于，所述的试剂进行实时荧光定量PCR的反应程序为：42℃逆转录20min；94℃预变性，2min；95℃变性，30s，58℃，45s，此时收集荧光，进行40个循环。

6.权利要求1-5所述的试剂在制备检测癌细胞的检测试剂中的应用，所述癌细胞为结直肠腺癌、头颈部鳞状细胞癌。