[发明专利]一种茶树咖啡因合成酶CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建方法

权利要求书

1.一种茶树咖啡因合成酶CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建方法，其特征在于，该方法步骤如下：

1)以茶树咖啡因合成酶基因为基础设计两条靶序列，其中靶序列T1为：5’-CTCACAAGCAGAGAAGGCT-3’,靶序列T2为5’-ATATCACTGCTGTGGCAGC-3’；

2)构建靶序列T1和T2的sgRNA表达盒：

以pYLgRNA-AtU3d-LacZ质粒为模板进行第一轮PCR反应，获得sgRNA表达的启动子片段和连接T1靶序列的gRNA片段，再通过重叠PCR反应将该启动子片段与gRNA片段连接，以组装成T1sgRNA表达盒；其中，该第一轮PCR反应包括两个PCR反应，该两个PCR反应分别在两个PCR管中进行后再将两个反应产物混合；第一个PCR反应使用的引物序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.6所示，第二个PCR反应使用的引物序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.4所示；重叠PCR反应使用的引物序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10；

以pYLgRNA-AtU3b质粒为模板进行第一轮PCR反应，获得sgRNA表达的启动子片段和连接T2靶序列的gRNA片段，再通过重叠PCR反应将该启动子片段与gRNA片段连接，以组装成T2sgRNA表达盒；其中，该第一轮PCR反应包括两个PCR反应，该两个PCR反应分别进行后再将两个反应产物混合；第一个PCR反应使用的引物序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.8所示，第二个PCR反应使用的引物序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.4所示；重叠PCR反应使用的引物序列如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示；

上述提及的构建T1sgRNA和T2sgRNA表达盒的第一轮PCR反应时的反应体系为：H₂O 13.65μL、10×Buffer2μL、2mM的dNTP1.5μL、25mM的MgSO₄0.6μL、5mM的正向引物0.6μL、5mM的反向引物0.6μL、模板0.75μL、1U/μL的KOD-Plus酶0.3μL，总体积20μL；反应程序：94℃预变性3min，30个循环，94℃20s，58℃20s，68℃25s；

上述提及的构建T1sgRNA和T2sgRNA表达盒的重叠PCR反应时的反应体系：H₂O 19.4μL、10×Buffer 3μL、2mM的dNTP3μL、25mM的MgSO₄1.2μL、10mM的正向引物0.9μL、10mM的反向引物0.9μL、稀释10倍的第一轮PCR产物1μL、1U/μL的KOD-Plus酶0.6μL，总体积30μL；反应程序：94℃预变性5min，22个循环，94℃25s，58℃25s，68℃30s；

3)利用限制性内切酶BsaI-HF和连接酶T4DNA ligase，将双元表达载体pYLCRISPR/Cas9P35S-H与上述T1sgRNA表达盒及T2sgRNA表达盒进行酶切-连接反应，使T1sgRNA表达盒与T2sgRNA表达盒连接后插入该双元表达载体中，从而获得CRISPR/Cas9基因组编辑载体；其中，该酶切-连接反应程序为：37℃孵育1min，16℃孵育1min，30个循环，最后75℃灭活内切酶5min。