[发明专利]一种一体式T细胞培养提取方法

说明书

本发明涉及一种一体式T细胞培养提取方法，将血液标本输入至容器内，磁珠颗粒的抗体与血液标本中的T细胞发生反应，完成T细胞的分离；将血液标本中未与磁珠颗粒反应结合的细胞经容器流出至废液袋，同时往容器中输入生理盐水进行冲洗；冲洗结束后，将培养液输入至容器中，磁珠颗粒上吸附的T细胞在容器中进行培养；T细胞在容器中扩增，将病毒转染液输入至容器内，进行T细胞的转染；转染后的T细胞在容器中进行后续扩增至特定数量；然后将T细胞从磁珠颗粒表面洗脱，输入至一含有生理盐水的输液袋中供临床使用，使得病人与病人之间的细胞在同一个空间之内互相之间没有机会接触和产生可能的交叉污染。

技术领域

本发明涉及医疗技术领域,特别针对外周血免疫T细胞分离、培养、扩增和转染，是一种一体式T细胞培养提取方法，尤其针对嵌和抗原受体T细胞（CART）培养、自然杀伤T细胞培养和肿瘤特异T细胞受体T细胞（TCRT）。

背景技术

外周血淋巴细胞培养是一种常见的体外细胞培养技术，其中涉及外周血淋巴细胞的分离，一般采用FICOLL梯度离心吸取淋巴细胞层到一个培养皿中，或者用吸附CD3或CD28抗体的磁珠特异性吸附T淋巴细胞在磁珠表面，然后用普通培养皿里培养，用吸管吸取淋巴细胞到一个培养皿中加入培养液进行培养，这种培养是在一个开放的细胞培养通风厨（洁净工作台）中完成，空间大转移过程容易受到空气中的细菌病毒等微生物的污染，放在37^oC细胞培养箱中培养。在转染时，需要移出来放到通风厨里面换液加转染液，然后再放回到37^oC细胞培养箱中培养，中间还需要反反复复从细胞培养箱里面拿出来到洁净工作台，又从洁净工作台到细胞培养箱中，一直到培养完成。临床上CART细胞培养做这样的操作程序只能一次一个病人，两个病人在同一个细胞培养房内是不允许的，因为无法保证两个病人的血细胞培养不互相交叉污染，因此目前临床级别的血淋巴细胞培养在这种开放培养方式下手续烦琐，效率低下，人力物力消耗很大，成本很高，无法大规模推广。

发明内容

本发明的目的是针对以上不足之处，提供了一体式T细胞培养提取方法，成本低，占用空间小，将细胞培养分离、培养、扩增、转染、后续扩增和提取融为一体，避免交叉感染。

本发明解决技术问题所采用的方案是：一种一体式T细胞培养提取方法，其特征在于，将血液标本输入至一密闭的容器中，所述容器容置于一密闭的37℃的保温箱内，在所述容器中依次完成T细胞的分离、培养、扩增、转染、后续扩增和提取，包括以下步骤：

步骤S1：将血液标本经容器顶部的入口输入至容器内，容器内容置有若干个磁珠颗粒，每个磁珠颗粒上附着有用于与血液标本中T细胞或自然杀伤T细胞结合的抗体，所述抗体与血液标本中的T细胞发生反应，进行充分结合，完成T细胞的分离；

步骤S2：通过一电磁铁将磁珠颗粒吸附聚集于容器内侧壁上，将血液标本中未与磁珠颗粒反应结合的细胞经容器底部的出口流出至废液袋，同时往容器中输入生理盐水进行冲洗；

步骤S3：冲洗结束后，关闭容器的出口，将培养液和含有空气和CO2的混合气体输入至容器中，同时电磁铁断电，磁珠颗粒上吸附的T细胞在容器中进行培养，计算此时T细胞的数量为N，N为正整数，且大于0；

步骤S4：在培养液的作用下，T细胞在容器中扩增，待T细胞的数量大于5N时，将病毒转染液输入至容器内，进行T细胞的转染；

步骤S5：转染后的T细胞在容器中进行后续扩增至特定数量；

步骤S6：打开容器的出口，容器中的培养液流出至一废液袋中；

步骤S7：将生理盐水输入至容器内水加力将T细胞从磁珠颗粒表面洗脱，将T细胞提取输入至一含有生理盐水的输液袋中供临床使用。