[发明专利]一种淡紫拟青霉壳聚糖酶的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种淡紫拟青霉壳聚糖酶的制备方法，以及其在壳寡糖生产中 的应用，属于生物技术领域。

背景技术

壳聚糖是由D-氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接的一类阳离子型氨基多糖， 是几丁质部分或完全脱乙酰基的衍生物，在过去的几十年里壳聚糖作为潜在的 生物活性物质被广泛研究，但是壳聚糖的应用仍存在一些缺陷，如在生理条件 下的低溶解性和高粘度导致其有效应用受到阻碍。壳寡糖是壳聚糖经水解后产 生的一类聚合度在2-20且可溶于水的氨基糖类化合物，具有独特的生理活性和 优越的功能性质，在食品、农业、医药和化工领域具有重要应用，如可以作为 功能性食品添加剂和防腐剂，在农业上作为植物调节剂和生物防治剂，在医药 上可以作为抗癌和免疫系统的药物等。

壳寡糖的制备方法有酶法、氧化法和酸降解法，其中酶法制备壳寡糖具有 反应条件温和、可人为控制降解速率和产物相对分子质量、不产生二次污染等 优点。在酶法制备壳寡糖中，具有突出应用前景的是专一性酶(壳聚糖酶)转 化法制备，其相对于非专一性酶(如纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶、溶菌酶和果 胶酶等)来说，具有催化效率高、产物聚合度适中且具有高生理生化活性等突 出优点。壳聚糖酶(Chitosanase，EC3.2.1.132)作为一类催化氨基葡萄糖间的 β-1,4-糖苷键断裂，专一性降解壳聚糖的糖苷水解酶，是在催化壳聚糖底物水解 转化制备壳寡糖的产业化领域具有重要应用前景的酶类，尤其是在低分子量且 高生理活性的壳寡糖制备方面的应用引人注目。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种淡紫拟青霉壳聚糖酶的制备方法及 其应用，本发明是在筛选获得一株用于番茄和葡萄根结线虫害防治的淡紫拟青 霉(发明专利CN104818216A)的基础上，研究表明该菌株高产壳聚糖酶，以 此优化其培养工艺，并确立了简单易行的壳聚糖酶制备及纯化方法，所述纯化 方法采用成本较低且操作简单的一次柱纯化工艺制备精纯壳聚糖酶，有别于以 往的二次层析制备工艺，所述纯化后的壳聚糖酶可通过高效水解壳聚糖来生产 高生理活性的壳寡糖。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

淡紫拟青霉YT08菌株，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2014年 11月26日，保藏号为CGMCCNo.10026，分类命名：淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)。

一种淡紫拟青霉壳聚糖酶的制备方法，包括如下步骤：1)粗酶制备：淡紫 拟青霉YT08发酵液经10000r/min离心5min，去除菌体后收集保留上清液，然 后再经微孔过滤膜过滤除淡紫拟青霉YT08菌体，即为粗酶液；

(2)淡紫拟青霉壳聚糖酶纯化：在步骤(1)获得的粗酶液中加入固体硫 酸铵至30％的饱和度，4℃冰箱冷藏静置5～10h后，离心去除杂蛋白，并收集 上清液；离心去杂蛋白后的上清液上再加入固体硫酸铵至80％的饱和度，4℃冰 箱冷藏静置过夜，离心，收集沉淀；用pH5.0的0.2mol/LHAc-NaAc缓冲液溶 解沉淀，在透析袋中透析除盐，透析后的酶液经PEG4000浓缩后经Sephadex G-100柱层析纯化，用0.2mol/LpH5.0HAc-NaAc缓冲液洗脱，流速在0.5～1 mL/min；检测每管酶液的酶活力和蛋白含量，合并酶峰部分的酶液，最后经 PEG4000浓缩，即得纯化后的淡紫拟青霉壳聚糖酶，冷冻干燥后制得固态淡紫 拟青霉壳聚糖酶。

进一步，淡紫拟青霉壳聚糖酶粗酶液的制备方法为(1)菌种活化：取保存 淡紫拟青霉YT08菌种接种于活化培养基中，在28℃、200rpm下培养至菌体浑 浊，制得活化种子液；

(2)发酵生产壳聚糖酶：按照0.2～0.8％(v/v)的接种量在灭菌后的发酵 培养基中接入步骤(1)活化种子液，在180rpm的旋转摇床中培养，控制温度 为30～34℃，发酵3-5d后培养完毕，发酵液经离心过滤除菌后直接作为壳聚糖 酶液使用；或者在发酵罐中以70％的体积比例装入发酵培养基，经118℃蒸汽灭 菌20min后，按照0.2～0.8％(v/v)的比例接入活化的菌种，控制发酵过程中的 pH始终维持在pH5～6.5，调节培养温度在30～34℃，溶解氧维持在10％(mg/ml) 以上，经发酵2-4d后发酵完毕，经离心过滤除菌后直接作为壳聚糖酶液使用。