[发明专利]一种快速筛选天然产物中拓扑异构酶I抑制剂的方法

说明书

发明领域

本发明涉及天然产物分析领域，尤其涉及一种快速筛选天然产物中拓扑异构酶I抑制剂的方法；具体地说，本发明是利用超滤膜技术与色谱、质谱联用技术从天然产物提取物或其单体化合物中快速筛选拓扑异构酶I抑制剂的方法。

背景技术

DNA拓扑异构酶I，是广泛存在于原核和真核生物体内的一种必需酶，其催化部位的酪氨酰残基攻击DNA单链，使得酶与DNA 3'-磷酸二脂键形成共价连接，造成DNA单链的断裂，从而通过调节超螺旋、连锁、去连锁以及核酸解结作用，影响DNA拓扑结构。靶向药物是目前应用于癌症治疗的最先进的药物，它通过与肿瘤发生、生长所必需的特定靶点作用来阻止肿瘤细胞的生长。研究发现，拓扑异构酶在肿瘤细胞中表现出不受其他因素影响的高水平表达，特别是结肠癌、宫颈癌和卵巢癌等的拓扑异构酶I含量及活性远高于正常体细胞，尤其在S期肿瘤细胞中活性大幅提高。因此，拓扑异构酶I抑制剂可选择性地抑制增殖期肿瘤细胞DNA复制，阻止肿瘤细胞快速增殖，进而杀死肿瘤细胞。由于拓扑异构酶I抑制剂具有众多优越性，美国国家癌症研究所药物机制分析电脑网络系统已将拓扑异构酶I抑制剂列为重点研究的六大类抗肿瘤药物之一，该酶已成为设计新型抗癌药物的重要新靶点，对其抑制剂的研究可为肿瘤的治疗提供新的临床药物和技术手段。

拓扑异构酶I抑制剂的常规筛选法一般使用光谱法、表面等离子共振法、X射线散色法、量热法和核磁共振法等(Chenxi Yao，Na Na，Lingyun Huang，Dacheng He，Jin Ouyang.Analytica Chimica Acta，2013，79，60-66；Vanisree Mulabagal，Angela I.Calderon，Analytical Chemistry，2010，82，3616–3621)，上述方法方便快捷，可在一定程度上满足筛选需求。然而光谱法因存在背景干扰而易产生假阴性和假阳性结果；核磁共振检测过程不能提供快速交换反应中蛋白质-配体相互作用的详细特征等。超滤质谱连用技术结合了超滤装置优良的分离功能与质谱技术高速、高灵敏性、高准确度等特性，具有分析速度快、特异性强和高通量的特点，可便捷地识别与生物靶分子相结合的药物配体，同时样品分析用量少、谱图信息量大，在药物小分子配体和生物大分子受体相互作用研究方面具有很大的优势(Shun Xiao，Runru Yu，Ni Ai，Xiaohui Fan.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2015，104，67–74；Xingxin Yang，Dan Wang，Zhiwei Yang，et al.Journal of Chromatography A，2015，1413，33–46)。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种快速筛选天然产物中拓扑异构酶I抑制剂的方法，可用于分析天然产物提取物或者单体化合物对拓扑异构酶I体外富集率。

本发明的目的是这样实现的：

本发明所述的天然产物提取物或者单体化合物对拓扑异构酶I体外富集率是指天然产物提取物或者单体化合物与拓扑异构酶I进行孵化和结合后，受体-配体复合物经有机溶剂处理使小分子配体释放出来，用液相-质谱检测释放出来的活性化合物，计算各成分与拓扑异构酶I结合的浓度变化及其比值。

具体地说，本方法包括以下步骤：

所述的超滤质谱联用技术是指一种将超滤膜技术与色谱、质谱分析方法联合使用所形成的一种新的研究手段；

所述的拓扑异构酶I抑制剂是天然产物提取物或其单体化合物；本发明天然产物鼠李提取物、石蒜生物碱提取物、单体化合物重楼皂苷I、II、VI和VII；

①酶结合反应缓冲液的配制

酶结合反应缓冲液包括：

醋酸钾：50毫摩尔/升，三羟甲基氨基甲烷-醋酸：20毫摩尔/升，

醋酸镁：10毫摩尔/升，二硫苏糖醇：1毫摩尔/升；

精确称取醋酸钾4907毫克、三羟甲基氨基甲烷-醋酸2422.8毫克、醋酸镁2144.6毫克和二硫苏糖醇154.3毫克，使用去离子水溶解至终体积为1升，充分混合后，25℃下pH值为7.9；

②待测样品的配制

精确称取适量待测样品，用酶结合反应缓冲液充分溶解，待测液终浓度为1.0-3.0毫克/毫升；

所述的待测样品是鼠李提取物或石蒜生物碱提取物；

③标准溶液的配制