[发明专利]一种家蚕shRNA表达载体构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于昆虫病毒基因工程领域，具体涉及一种新的体外合成单长链DNA退火 的方法的家蚕shRNA表达载体的构建方法和应用。

背景技术

在哺乳动物和无脊椎动物中，RNA干扰技术是研究基因功能的重要手段之一。当内源 性或外源性双链RNA（dsRNA）进入细胞后，dsRNA会被切割成21-23bp长的小分子干扰RNA。 这些小分子干扰RNA形成沉默复合物后通过碱基配对定位到同源mRNA上，随后降解mRNA从 而抑制基因表达。

目前进行RNA干扰的常用方法有两种：一种通过体外合成21-23nt的siRNA后转染 细胞来进行RNA干扰，另一种通过shRNA表达载体在RNA聚合酶III启动子的作用下在细胞内 过表达shRNA(该shRNA由19-29nt的发夹结构和4-23bnt的环形结构组成)。尽管前者方法简 单，但成本耗费高而且只能进行短暂的干扰。而shRNA载体介导的RNA干扰持续时间更长，并 且能做稳定细胞系的筛选。

家蚕中大约有15000个基因，然而大部分基因的功能未知。在昆虫细胞尤其是在家 蚕细胞中，目前进行RNA干扰主要采取体内导入外源dsRNA的方式进行干扰。但是这种方法 存在诸多缺点，如干扰效果是瞬时的、干扰效应效果差等弊端。本专利中我们描述了一种通 过构建昆虫shRNA载体的方法，可快速、高效的实现shRNA克隆表达，具有成本低、构建效率 快、抑制效率高的特点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种全新的家蚕shRNA干扰载体及其构建方法，具体来说本发 明涉及一种新的体外退火合成双链DNA来构建shRNA表达载体和应用。

本发明的shRNA克隆方法包括shRNA载体的构建、体外单链退火形成长双链DNA并 克隆到shRNA干扰载体，并通过转换大肠杆菌进行扩增和鉴定。

一种家蚕shRNA表达载体构建方法，按照下述步骤进行：

（1）运用primer5软件设计基因特异性引物，该引物末端含有BspHI和HindIII酶切位 点。

（2）构建shRNA载体采用家蚕RNA聚合酶IIIU6-2启动子，该启动子3’末端含有BspH I和HindIII酶切位点。具体方法为：通过PCR技术（反应条件：94℃预变性5min；94℃ 1min，55℃1min，72℃1min（循环30次）；72℃10min）扩增家蚕RNA聚合酶IIIU6-2启动 子。反应条件（10×Buffer：5μl，引物：2μl，DNA模板：0.1μg，dNTPs：4μl.Taq酶（5U/μl）: 0.5μl,ddH2O:补齐至50μl）。将该片度通过胶回收纯化后进行BspHI和HindIII酶切 （酶切体系为：BspHI和HindIII各0.5μl，10×Buffer：2μl，模板：1μl，ddH₂O补齐至20μ l。37℃孵育3h）。将该片段和用同样酶切的载体pIB/V5-his连接（反应体系为：10×T4 ligasebuffer：1μl，T4ligase：1μl，反应体积10μl，4℃连接过夜）。

（3）体外合成的单长链由21nt的发夹结构和6nt的环形结构组成。6nt的环形结构 由CTCGAG序列组成。合成的两条互补单长链片段在体外退火后通过自身互补配对形成长双 链DNA片段。体外具体方法为：通过上海生工合成的正义链和反义链。合成的正义链和反义 链通过体外复性形成双链结构。反应体系：10×NEB变性缓冲液：2.5ul，正义链和反义链各 25ul，反应条件为:95℃加热5min，冷却到室温约2-3h。

（4）退火形成长双链DNA片段末端为粘性末端，且同为5’或3’端的突出端。突出的 末端为5个碱基，分别为CATGA和CTAGA。退火形成长双链DNA和构建的载体通过BspHI和Xba I酶切位点连接形成shRNA干扰载体。酶切条件为（BspHI和XbaI各0.5μl，10×Buffer：2μ l，模板：1μl，ddH2O补齐至20μl,37℃孵育3h）。连接条件为（反应体系为：10×T4ligase buffer：1μl，T4ligase：1μl，反应体积10μl，4℃连接过夜）。